核酸染色技術(shù)——Feulgen顯示DNA法

世界上大多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)主要是核酸，無論生物處在、生長、發(fā)育、變異等任何一個生命階段都要受到核酸的調(diào)節(jié)。因此核酸成為人們了解生物的研究對象。核酸太小，我們無法用肉眼看到，只能通過顯微和染色技術(shù)，我們才能看到它們。

一、DNA和RNA的簡單結(jié)構(gòu)

組成DNA分子的脫氧核糖酸主要有四種，即dAMP、dGMP、dCMP和dTMP，它有三個級別的結(jié)構(gòu)即一級、二級和三級。

一級結(jié)構(gòu)是由四種脫氧核糖核苷酸通過3,′-5′磷酸二酯鍵被此連接而成的線狀或環(huán)狀大分子，沒有側(cè)鏈。

二級結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，以一共同軸為中心，以一條5′-3′，另一條為3′-5′相反向，但互相平行的脫氧核糖苷酸鏈組成(即所稱的麻花結(jié)構(gòu)).

三級結(jié)構(gòu)是指雙螺旋鏈作進一步的扭曲構(gòu)象。

組成RNA的四種堿基分別是：腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶。

核酸受許多條件的制約，如溫度、酸堿性試劑等。

zui常導(dǎo)致核酸變化的是核酸的變性，當(dāng)溫度升高至50℃以上時，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)即被破壞，氫鍵斷裂，原來的兩條結(jié)構(gòu)鏈被彼此分開，涉及此種情況的是免疫組化染色方法時的前期處理，如抗原修復(fù)，微波輻射技術(shù)，水溶鍋或者高壓鍋的抗原修復(fù)等，都涉及至雙鏈的變化(見抗原修復(fù)法)。本文只談核酸的形態(tài)學(xué)的顯示。

二、Feulgen顯示DNA法

1.切片應(yīng)用硅化玻片裱片后烘烤2h。

2.切片脫蠟至水。

3.用5NHCL于20℃處理切片40分鐘。

4.直接進入Schiff試劑作用60分鐘左右。

5.0.5%偏重亞硫酸鈉洗3次，1-2分鐘/次。

6.流水沖洗5-10分鐘。

7.脫水、透明，中性樹膠封固。

結(jié)果：DNA呈鮮紅色或紫紅色。

注意事項：

1.該法也可應(yīng)用1NHCL水解切片，但液體需預(yù)熱至60℃。

2.臨用時配制5NHCL，在加入HCL時，液體溫度可升高，這樣可減少切片水解的作用時間。

3.水解所用的1NHCL和5NHCL兩種，根據(jù)實驗證明，5NHCL比，1NHCL效果較好。

4.顯示完DNA后，也可用淡綠等襯染背景，使背景呈現(xiàn)為綠色。

5.組織塊固定可用甲醛配成的固定液如中性緩沖福爾馬林液，Carnoy氏液，Helly氏液等固定，但不能用Bouin液固定，固用它固定會引起組織的過度水解。

三、核仁組成區(qū)和酸性粘多糖復(fù)合顯示法(Combining method for Argyrophilic proteins of the nucleolar organizer regions and acid musin)

(1)試劑的配制：

①2%的甲酸和2%的明膠各一份，加入50%的硝酸銀2份，測PH值約2-2.5。

②取0.5g阿申藍(8GX)溶于3%的醋酸溶液中100ml，PH2.5。

(2)操作步驟：

①切片脫蠟至水，浸入蒸餾水中。

②浸入膠性銀液中在暗室室溫中染30-40

③蒸餾水*沖洗

④滴阿申藍液于切片上于室溫染色30分鐘。

⑤水洗。

⑥常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

結(jié)果：核仁組成區(qū)(AgNOR)顯示大小不一的黑色顆粒;酸性粘多糖呈現(xiàn);深淺不一的藍綠色。

四、粘多糖和核仁組成區(qū)雙染法(Double staining for cabohydrate and ANOR)

(1)試劑配制：

a)Schiff氏試劑見前。

b)膠性銀液見前。

(2)操作方法：

①切片脫蠟至水;

②蒸餾水浸泡;

③0.5%高碘酸水溶液氧化切片10min;

④流水洗，蒸餾水浸洗1min;

⑤Schiff氏試劑浸染20min。(避光)

⑥1%偏重亞硫酸鈉或鉀水溶液浸洗3次，每次1min;

⑦自來水沖洗，蒸餾水洗1min;

⑧膠性銀液浸染40min (暗室);

⑨蒸餾水充分浸洗;

⑩常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

結(jié)果：粘多糖呈深淺不一的紅色，AgNOR呈現(xiàn)大小不一的黑色顆粒，炎性及良性腫瘤，AgNOR呈較均勻一致的黑色顆粒，無分葉或較少分葉。如為惡性腫瘤，AgNOR則呈現(xiàn)大小不一的黑色顆粒，分葉較多，有的多達3-5個分葉。背景呈現(xiàn)淡黃*色。

(3)注意事項：

①PAS-膠性銀染色注意染色的順序，如果先染膠性銀，再染PAS，則不能順利完成，因為當(dāng)染完膠性銀后，再染PAS時，由于切片需要用高碘酸氧化切片，使切片中含有1：2乙二醇基氧化而產(chǎn)生游離醛，但這種氧化的同時，也將已著染的氧化銀顆粒給氧化掉，造成雙染色的失敗。

②切片在Schiff氏試劑中應(yīng)根據(jù)其含量的多少來決定浸染的時間，含量多的浸染時間可以相對減少，含量少的浸染時間可以相對延長。

③膠性銀液的浸染應(yīng)根據(jù)室溫來確定浸染時間，室溫高浸染時間可相對減少，室溫低應(yīng)相對延長。

④慎防膠性銀過染，導(dǎo)致著染的銀顆粒分辨不清。

(4)臨床和研究性應(yīng)用

①用于良惡性腫瘤的鑒別診斷，良性腫瘤以及炎性組織，AgNOR的染色顆粒均勻一致，顆粒不粗，惡性腫瘤AgNOR的染色顆粒較粗，分葉較多，結(jié)構(gòu)不均勻，分布雜亂。

②DNA量的增加可確定腫瘤細胞的生長躍。在HE染色中，許多腫瘤細胞核染色加深，這是由于DNA或RNA量的增加所致。

生物體內(nèi)的核酸主要DNA和RNA兩類。DNA主要存在于細胞核中，RNA多數(shù)存在于細胞質(zhì)中，DNA通過RNA的表達來調(diào)控生物的生理時期和對外界環(huán)境的應(yīng)對。核酸染色技術(shù)利于我們了解在生物的生活狀態(tài)及其不同時期的核酸分布。