免疫組化技術(shù)的幾個關(guān)鍵問題

 1.組織處理
       恰當?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細胞材料準備的過程中，不僅要求保持組織細胞形態(tài)完整，更要保持組織細胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
       1） 組織及時取材和固定　
       組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵*步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進行取材，2h內(nèi)，取材時所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，（也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬不能超過0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定）。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細胞形態(tài)。
       對于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進行固定，但組織固定時間在l2h內(nèi)，一般固定時間不應(yīng)超過24小時。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。
       2） 組織脫水、透明、浸蠟　
       組織經(jīng)固定后進行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以*脫水和二甲苯透明的時間不宜過長，正常大小的組織*脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。
       2.切片
       組織得到很好處理后在進行切片之前還應(yīng)對玻璃片進行處理，由于我們檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時間較長，有些抗原是要進行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實驗的正常進行，要求在貼片前對載玻片作適當處理，必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防脫片。
       1）Poly-L-Lysine （多聚左旋賴氨酸）　　
       一般采用分子量30000左右的0.5%多聚賴氨酸，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點是可以用于多種組織化學、免疫組化及分子學檢測中的應(yīng)用，粘貼效果，但價格稍貴。
       2）明膠硫酸鉻鉀法　
       將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，*溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體變藍或粘稠狀停用。
       3）APES （3-氨丙基-乙氧基甲硅烷）　　
       此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。
       切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標記定位彌漫現(xiàn)象。
       3.免疫組化染色
       S—P免疫組化染色試劑盒采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細胞和組織中的抗原。
       S—P免疫組化染色步驟：
       1） 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（pH7．4）沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。
       2） 根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應(yīng)的修復(fù)。
       3） 每張切片加1滴或50ul過氧化酶阻斷溶液（試劑A），以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。
       4） PBS沖洗3×3’。
       5） 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul的非免疫性動物血清（試劑B），室溫下孵育10分鐘。
       6） 甩去血清，每張切片加1滴或50ul的*抗體（用戶自選），室溫下孵育60分鐘或4℃過夜，建議參閱每種抗體的說明書。
       7） PBS沖洗3×5’。
       8） 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul生物素標記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育10分鐘。
       9） PBS沖洗3×3’。
       10）甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育10分鐘。
       11）PBS沖洗3×3’。
       12）甩去PBS液，每張切片加2滴或100ul新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3—10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。
       13）自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS沖洗返藍。
       14）如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，（二甲苯透明），中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。