【化工儀器網 科技前沿】拉曼激活細胞彈射耦合測序(RACE-Seq)是微生物組單細胞分析的手段之一，但其基因組覆蓋度通常不超過10%，而且核酸擴增成功率低，極大限制了其應用。中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞中心系統(tǒng)評估和優(yōu)化了該技術，并改進了單細胞基因組擴增環(huán)節(jié)，從而提高了RACE-Seq的基因組覆蓋度和核酸擴增成功率。該工作近日發(fā)表于Analytical Chemistry。
 

　　作為微生物在自然界中的存在形式，微生物組(菌群；Microbiome)與人體和自然界的過去、現在和未來息息相關。但是，菌群中絕大部分微生物組分通常難以快速培養(yǎng)和利用，因此，微生物組又被稱為"生命暗物質”。如何識別和利用"生命暗物質”中的功能組分，一直是生命科學和環(huán)境科學中的一個共性方法學問題。
 

　　針對這個瓶頸，單細胞中心和業(yè)界同行前期發(fā)明了一系列單細胞拉曼分選技術與裝備(RACS-Seq; Biotechnol Adv, 2019; doi: 10.1016/j.biotechadv.2019.04.010)。RACS-Seq技術家族的工作原理均為，基于單細胞拉曼光譜來從菌群樣品中直接識別和分選特定代謝功能的細胞，進而與核酸提取、擴增和測序對接，從而深刻理解菌群中"誰在做什么？如何做？”。其中的RACE-Seq技術將菌群細胞風干后、在彈射芯片表面平鋪成單層，逐一采集拉曼光譜后，采用另一束激光將目標拉曼光譜的細胞從芯片表面彈射到接收芯片的小孔中，進而在小孔中進行核酸擴增和測序文庫制備。但是，在已發(fā)表的RACE-Seq應用于人體或菌群分析的工作中，單細胞基因組測序的覆蓋度普遍很低(很少超過20%，大多在10%以下)，同時其完整流程的成功率也不高，以致于通常需要把幾個乃至幾十個細胞彈射至同一個小孔中，混合進行基因組擴增和測序，以提高實驗的成功率。這種低覆蓋度而且混合測定的單細胞基因組數據，從根本上阻礙了在細胞"個體”水平的基因組結構分析與代謝功能重建。
 

　　為了揭示RACE-Seq基因組覆蓋率極低的原因，單細胞中心蘇曉璐與公衍海帶領的研究小組，基于長期努力，從實驗操作和數據計算分析兩個角度入手，建立了系統(tǒng)性的RACE-Seq方法和芯片的質量評估和控制體系。在此基礎上，全面、定量地評估了細胞裂解條件、核酸擴增條件和拉曼測量條件等每一環(huán)節(jié)的關鍵參數對RACE-Seq基因組測序質量的影響。結果發(fā)現，激光照射強度在拉曼信號采集過程中至關重要，并與單細胞核酸擴增(MDA)的成功率成反比。
 

　　針對這些問題，研究人員開發(fā)出了二代RACE-Seq(圖1):在單細胞擴增體系中加入特定油相并充分震蕩，產生大量隨機包裹的微體積液滴，造成每個DNA片段在破乳前均達到飽和擴增，從而大幅提高RACE-Seq中單細胞基因組的覆蓋度。這種操作方法簡單快速，而且容易實現自動化。
 

　　與第一代RACE-Seq相比，該二代技術可將純培養(yǎng)大腸桿菌(每個MDA體系含5個彈射出的細胞)單細胞基因組覆蓋度從 < 20% 提高到50%。針對土壤菌群樣品的測試表明(每個MDA體系含2~5個彈射出的細胞)，二代技術可將MDA反應的成功率從58%提高到 90%，而將MDA產物16S擴增成功率從0%大幅提升至83%?；谶@些優(yōu)點，單細胞中心開發(fā)了RACE-Seq試劑盒(圖2)，以服務于各種環(huán)境樣品和應用場景。
 

　　盡管如此，由于拉曼全譜采集對于細胞活性的破壞，RACE-Seq目前還難以實現在"一個”細菌細胞水平的高覆蓋度基因組測序或細胞培養(yǎng)。針對這些局限性，研究人員正在開發(fā)一系列液相拉曼分選耦合測序器件，以建立與完善一個高拉曼全譜信號質量、高基因組測序覆蓋度、高效保護細胞活性、一個細菌細胞精度的微生物組分析技術服務體系。
 

　　蘇曉璐和公衍海是論文的共同第一作者。該工作得到中科院先導B項目、青島海洋科學與技術試點國家實驗室、國家自然科學基金等的支持。