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用于寬場顯微鏡的高速熒光壽命成像

快速的細胞過程、移動的粒子和快速的圖像采集歷來是使用單光子計數(shù)技術(shù)進行壽命成像的挑戰(zhàn)。寬場 FLIM 套件通過在寬場照明裝置中實現(xiàn)視頻速率壽命成像，解決了這些限制。該套裝將Pi Imaging的高分辨率SPAD5122 相機與PicoQuant的多功能脈沖激光器組合以及通過NovaLITE軟件進行的GPU 加速FLIM分析結(jié)合在一起。它專為兼容光片和其他寬場顯微鏡系統(tǒng)而設(shè)計，通過脈沖激發(fā)和時域門控檢測引入了FLIM功能。NovaLITE簡化了數(shù)據(jù)分析，針對 TIFF 文件格式進行了優(yōu)化，確保了高效、準確的處理。

特點：

• 使用512x512像素時間門控SPAD相機進行寬場壽命成像

• 比共焦FLIM快達100倍

• 結(jié)合落射熒光和光片顯微鏡進行測試

• 激光選項適用于各種應(yīng)用

• 易于使用的基于GPU的分析軟件NovaLITE

應(yīng)用：

FLIM寬場顯微鏡的應(yīng)用

下面，我們將重點介紹我們的寬視場FLIM套裝所擅長的兩個關(guān)鍵應(yīng)用： 光片F(xiàn)LIM和寬場FLIM。從二維寬場顯微鏡到使用光片技術(shù)對活體樣本進行三維成像，每一種應(yīng)用都展示了寬場FLIM套件在為高級生物研究提供高速、高精度成像方面的多功能性。

光片F(xiàn)LIM

在光片顯微鏡（或選擇性平面照明顯微鏡，SPIM）中，樣品的一個平面被光片照射，光片通常由圓柱透鏡或來回掃描的光束產(chǎn)生。被照亮的平面隨后通過相機成像。光片顯微鏡因其快速、柔和和三維功能，非常適合對大型活體樣本進行研究。壽命成像提供的傳感或同步多路復用與這些優(yōu)勢相輔相成，使光片 FLIM 成為一種非常有效的組合。

我們與法國艾克斯-馬賽大學（Aix-Marseille Université）的研究人員合作，擴展了一種光片顯微鏡，以實現(xiàn)光片F(xiàn)LIM。該顯微鏡是一種專門的單物鏡光片，針對有機體的高通量成像進行了優(yōu)化。我們將該顯微鏡與用于脈沖照明的光纖耦合VisUV488和SPAD5122傳感器（高速版本）相結(jié)合，在類器官樣品上進行FLIM。

圖中顯示了光片 FLIM 如何用于同步多路復用。我們對小鼠胚胎干細胞生成的活體器官進行了成像。細胞核表達 H2B-GFP，細胞膜用 Flipper-TR 染色。

下面的視頻顯示的是有機體的三維成像，通過生命周期進行多路復用。對于該數(shù)據(jù)集，光片由來回掃描的高斯光束產(chǎn)生（488nm波長下的平均功率約為70µW），每個Z平面的采集時間為1.1s?？潭染€為50µm。

有關(guān)其他結(jié)果，包括不同光片模式與共焦 FLIM 的比較以及活體有機體的三維張力圖譜，請查閱 bioRxiv 上的預印本。

寬場 FLIM

在落射熒光寬場顯微鏡中，樣品的一個區(qū)域被準直激光束照射。然后將激發(fā)的熒光成像到相機上。為了進行寬場熒光成像，我們擴展了一臺落射熒光顯微鏡（Olympus IX73），配備了用于照明的光纖耦合高功率530nm激光器（LDH P-FA-530XL）和高速版 SPAD5122傳感器。

圖片顯示的是商用固定細胞樣本（Gattaquant，比例尺為5µm）的寬視場 FLIM 和共聚焦FLIM。線粒體和微管蛋白用光譜重疊的染料標記，但可通過壽命區(qū)分開來。即使在寬場 FLIM 上進行 40ms的采集，也能看到這種壽命對比。圖中顯示了隨著成像速度的增加，壽命直方圖的范圍也在擴大。采集時間為300ms的寬場圖像和采集時間為 5s的共聚焦圖像的壽命直方圖都是雙峰的。不過，共焦圖像中的生命周期分隔更大。這并不是門控采集的偽影，而是落射熒光顯微鏡缺乏切片的結(jié)果，在這種情況下，焦內(nèi)和焦外的壽命是混合的。寬視場 FLIM 圖像是在激光輸出平均功率約為10mW 的情況下記錄的，相當于視場中約50W/cm2。

寬場FLIM的高速性尤其有利于在對移動樣品成像時避免運動模糊。視頻顯示了大型熒光珠在水中自由漂浮的實時畫面（比例尺10µm）。溶液中含有兩種不同類型的珠子，它們具有相似的光譜特性，但壽命不同。在視頻中，以每秒23幀的幀頻，可以根據(jù)熒光珠的壽命清楚地分辨出兩種類型的熒光珠。

相關(guān)套件：

寬視場FLIM組件

照明選項

根據(jù)照明模式（如 Epi、TIRF、光片......）和樣品的不同，寬場 FLIM 應(yīng)用對照明光源的要求也大相徑庭。在目前測試的應(yīng)用中，所需的平均激光功率從數(shù)字掃描光片系統(tǒng)中的約 100 µW 到落射熒光寬場顯微鏡中的 25 mW 不等。我們將幫助您從 PicoQuant 大量的脈沖激光源組合中選擇適合您應(yīng)用的選項。

標準光源：

• LDH系列：皮秒半導體激光頭

• Prima3色增益開關(guān)皮秒激光器

高功率光源：

• VisUV：紫外、綠光、黃光和橙光皮秒激光器

• LDH-FA 系列：放大型皮秒脈沖半導體激光頭

探測器

探測器是Pi Imaging公司的SPAD5122 SPAD圖像傳感器，像素為512x512。該傳感器可通過納秒級的全局曝光進行時間分辨檢測，并能以皮秒級的精度相對于激光脈沖進行移動。該傳感器采用微透鏡，提高了填充因子，整體計數(shù)率高達15Gcps。

*通常情況下，套件默認包括標準版本，如需高速版本，請?zhí)崆皢栐儭?/p>

軟件

分析軟件 NovaLITE 讀取單個門控衰減測量值，并進行平均壽命、相位和擬合分析。用戶可以直觀地將壽命顯示為直方圖或相位圖。通過 GPU 加速擬合，可在數(shù)秒內(nèi)根據(jù)固定壽命擬合單次或多次指數(shù)衰減和物種分離。結(jié)果可導出為 TIFF 格式，以便進一步處理。請注意，NovaLITE 是一款純粹的分析軟件，數(shù)據(jù)采集由 SPAD5122 軟件處理，用戶可通過遠程接口將其集成到顯微鏡中。PicoQuant 的分析軟件使用通用的 TIFF 文件格式。這不是 SPAD5122 采集軟件的默認格式，文件需要轉(zhuǎn)換。

套裝包含：

• 一個或多個激光器，用于所需波長的脈沖照明

• 512x512 像素 SPAD 陣列探測器（PI Imaging 公司的 SPAD5122高速單光子相機）

• 用于執(zhí)行快速 FLIM、擬合和相位分析的分析軟件

• 技術(shù)和應(yīng)用驅(qū)動遠程支持

使用陣列探測器的門控FLIM原理

在共聚焦 FLIM 中，通過掃描像素來依次獲取壽命圖像。每個像素中的壽命信息與 TCSPC 檢測并行獲取，從而構(gòu)建壽命直方圖。相比之下，在門控 FLIM 中，整個圖像是并行采集的。然而，壽命信息是通過相對于熒光壽命衰減移動門來依次獲取的。時間分辨率是通過丟棄落在門外的光子生成的。因此，成像速度、時間分辨率甚至總探測效率都取決于采集參數(shù)，其方式比共焦熒光成像技術(shù)更為復雜。