貨號W0511/Plasmid Mini Kit質(zhì)粒小提試劑盒

保存：RNaseA ，2-8℃
      其他組分，室 溫
組分說明
KitSize 50 200
BufferP1 15ml 60ml
BufferP2 15ml 60ml
BufferN3 20ml 80ml
BufferPS 15ml 60ml
BufferPW（concentrate） 15ml 50ml
BufferEB 10ml 30ml
RNaseA（10mg/ml） 150μl 600μl
SpinColumnCM 50 200
CollectionTube（2ml） 50 200
產(chǎn)品簡介
    本試劑盒提供一種簡單快捷提取質(zhì)粒的方法，快速獲得大量的質(zhì)粒DNA。采用堿裂解法裂解細(xì)胞，新型硅基質(zhì)膜高
效專一性結(jié)合質(zhì)粒DNA，*的緩沖液系統(tǒng)洗去雜質(zhì)，無需酚抽提和乙醇沉淀。本試劑盒在保證提取量和純度的前提下，
大大簡化提取步驟，可從1-5 ml菌液中純化多達(dá)30 μg的高拷貝質(zhì)粒DNA。得到的DNA可直接用于PCR、酶切、測序、
轉(zhuǎn)化等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. BufferP1 在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA 全部加入），混勻，置于2–8℃保存。
2. *次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 BufferPW 中加入無水乙醇。
3. 使用前請檢查 BufferP2、BufferN3 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象，可在37℃水浴幾分鐘，即可
恢復(fù)澄清。
4. 注意不要直接接觸 BufferP2 和BufferN3，使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子。
5. 提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。
6. 所有離心步驟均為使用常規(guī)臺式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心。
自備：無水乙醇，離心管


操作步驟
1.  取1-5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管（自備）中，12,000rpm（~13,400×g）離心1分鐘，盡量吸棄上清。
注意：如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0 kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加BufferP1、P2、N3的用量；洗脫緩沖液推
薦在65~70℃水浴中預(yù)熱；可以適當(dāng)延長吸附和洗脫時間，以提高提取效率。
2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μlBufferP1（使用前請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩
器*懸浮細(xì)菌沉淀。
  注意：如果菌塊未*混勻，將會影響裂解效果，使提取量和純度偏低。
3. 向離心管中加入250μlBufferP2，溫和地上下顛倒混勻4-6次，使菌體充分裂解，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠。所用
時間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。
     注意：不要劇烈震蕩，以免造成所提質(zhì)粒中出現(xiàn)基因組DNA污染。如果溶液未變得清亮，提示可能菌量過大，裂解不*，應(yīng)減少菌體量。
4.  向離心管中加入350μlBufferN3，立即溫和地上下顛倒混勻4-6次，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12,000rpm離心10
分鐘，此時在離心管底部形成沉淀。
注意：BufferN3加入后應(yīng)立即充分混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5. 柱平衡：向已裝入收集管（CollectionTube）的吸附柱（SpinColumnCM）中加入200 μlBufferPS，12,000rpm
離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6. 將步驟4中所得上清加入到已裝入收集管的吸附柱中，注意不要吸出沉淀，12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的
廢液，將吸附柱放回收集管中。
7. 向收集管中加入600μlBufferPW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
8. 重復(fù)步驟7。
9. 將吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇?xì)埩魰绊懞罄m(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。
10. 將吸附柱置于一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μlBufferEB，室溫放置數(shù)分鐘，12,000rpm
離心1分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。-20℃保存質(zhì)粒。
注意：1）為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟10。BufferEB在65-70℃水浴預(yù)熱，適當(dāng)延長吸附和
洗脫時間，可以增加提取效率。
2）洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），
pH值低于7.0會降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μl，體積過小會影響回收效率。
3）如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。