Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄酶供應(yīng)

    Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄酶是一種莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶，這個(gè)酶已經(jīng)作了遺傳性上的改變，即除去了與它聯(lián)在一起的核糖核酸酶H活性(一種專門切割DNA與RNA雜交鏈上RNA分子的酶)。這個(gè)酶應(yīng)用于cDNA的*鏈合成和引物的延伸。

    Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。

    Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng)

    在進(jìn)行RT反應(yīng)之前，應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：

    1、RNA

    成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA，高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中，要特別防止RNase的污染，同時(shí)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在*鏈cDNA合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白R(shí)Nase抑制劑僅防止RNaseA，B，C對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)常更換新手套。

    2、引物的選擇

    選擇OligodT時(shí)，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議*使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。

    隨機(jī)引物

    適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，*鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5μg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片斷、全長產(chǎn)物產(chǎn)物的降低。

    特異性引物

    特異性引物只能用你設(shè)計(jì)引物時(shí)的下游引物做RT，引物設(shè)計(jì)質(zhì)量影響RT的結(jié)果，而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以按照說明書按照一個(gè)溫度做不是*選擇，一般不*。