ATP含量分析試劑盒-企業(yè)新聞資訊

ATP含量測試盒

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一、ATP含量測試盒測定意義：

三磷酸腺苷（Adenosine 5'-triphosphate，ATP）是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體, 其含量的變化直接關(guān)系到各器官的能量代謝。ATP 作為最重要的能量分子在細(xì)胞的各種生理、病理過程中起著重要作用。ATP 水平的改變，會影響許多細(xì)胞的功能。通常細(xì)胞在凋亡、壞死或處于一些毒性狀態(tài)下，ATP 水平會下降，而高葡萄糖刺激等對于一些細(xì)胞可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP 水平。通常 ATP 水平的下降表明線粒體的功能受損或下降，在細(xì)胞凋亡時 ATP 水平的下降通常和線粒體的膜電位下降同時發(fā)生。

二、ATP含量測試盒測試原理：

本試劑盒根據(jù)螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)催化熒光素產(chǎn)生熒光時需要 ATP 提供能量研制而成。當(dāng)螢火蟲熒光素酶和熒光素都過量時，在一定的濃度范圍內(nèi)熒光的產(chǎn)生和ATP 的濃度成正比。這樣就可以高靈敏地技術(shù)溶液中的 ATP 濃度。

本試劑盒在樣品體積為 100μl 時可以技術(shù)濃度低達(dá) 1nmol/L 的 ATP。而常規(guī)的細(xì)胞或組織裂解液中 ATP 的濃度僅為 0.1- 1μmol/L，一些常見細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi) ATP 水平約為10nmol/mg

蛋白。

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三、ATP含量測試盒試劑組成及配制：（200T ）

試劑組成 試劑名稱 包裝規(guī)格

R1 裂解液 100ml

R2 底物酶貯備液 0.5ml×4 支

R3 底物酶稀釋液 20ml

臨用前，取適量的酶貯備液，用酶稀釋液按照 1:9 的比例稀釋，配制成酶工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

R4 標(biāo)準(zhǔn)品 0.1ml

四、ATP含量測試盒保存條件：

-20℃保存 6 個月。-80℃可保存一年。底物酶貯備液需 避光保存。ATP 含量測試盒說明書

（貨號：A095-2 200T 化學(xué)發(fā)光法）

一、測定意義：

三磷酸腺苷（Adenosine 5'-triphosphate，ATP）是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體, 其含量的變化直接關(guān)系到各器官的能量代謝。ATP 作為最重要的能量分子在細(xì)胞的各種生理、病理過程中起著重要作用。ATP 水平的改變，會影響許多細(xì)胞的功能。通常細(xì)胞在凋亡、壞死或處于一些毒性狀態(tài)下，ATP 水平會下降，而高葡萄糖刺激等對于一些細(xì)胞可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP 水平。通常 ATP 水平的下降表明線粒體的功能受損或下降，在細(xì)胞凋亡時 ATP 水平的下降通常和線粒體的膜電位下降同時發(fā)生。

二、測試原理：

本試劑盒根據(jù)螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)催化熒光素產(chǎn)生熒光時需要 ATP 提供能量研制而成。當(dāng)螢火蟲熒光素酶和熒光素都過量時，在一定的濃度范圍內(nèi)熒光的產(chǎn)生和ATP 的濃度成正比。這樣就可以高靈敏地技術(shù)溶液中的 ATP 濃度。

本試劑盒在樣品體積為 100μl 時可以技術(shù)濃度低達(dá) 1nmol/L 的 ATP。而常規(guī)的細(xì)胞或組織裂解液中 ATP 的濃度僅為 0.1- 1μmol/L，一些常見細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi) ATP 水平約為 10nmol/mg蛋白。

三、試劑組成及配制：（200T ）

試劑組成 試劑名稱 包裝規(guī)格

R1 裂解液 100ml

R2 底物酶貯備液 0.5ml×4 支

R3 底物酶稀釋液 20ml

臨用前，取適量的酶貯備液，用酶稀釋液按照 1:9 的比例稀釋，配制成酶工

作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

R4 標(biāo)準(zhǔn)品 0.1ml

四、保存條件：

-20℃保存 6 個月。-80℃可保存一年。底物酶貯備液需 避光保存。五、樣本前處理：

1 、貼壁細(xì)胞：

吸除培養(yǎng)液，按照 6 孔板每孔加入 200μl 裂解液裂解細(xì)胞。裂解細(xì)胞時為了裂解充分，可以使用移液器進(jìn)行反復(fù)吹打，或晃動培養(yǎng)板使裂解液充分接觸并裂解細(xì)胞。通常細(xì)胞在接

觸裂解液后會立即裂解。裂解后 4℃,12000g 離心 5 分鐘，取上清，用于后續(xù)的測定。

2 、懸浮細(xì)胞：

用離心管離心沉淀細(xì)胞，棄上清，輕輕彈散細(xì)胞，按照 6 孔板每孔加入 200μl 裂解液裂

解細(xì)胞。裂解細(xì)胞時為了裂解充分，可以彈擊離心管管底，適當(dāng) Vortex 使裂解液充分接觸

并裂解細(xì)胞。通常細(xì)胞在接觸裂解液后會立即裂解。裂解后 4℃，12000g 離心 5 分鐘，取上清，用于后續(xù)的測定。

3 、組織樣本：

按照每 20 毫克組織加入約 100-200μl 裂解液的比例加入裂解液，然后用玻璃勻漿器或其

它勻漿設(shè)備進(jìn)行勻漿。充分勻漿可確保組織被*裂解。裂解后 4℃，12000g 離心 5 分鐘，取上清，用于后續(xù)的測定。

六、操作步驟

1、加 100μl 酶工作液到技術(shù)孔或技術(shù)管內(nèi)。室溫放置 3-5 分鐘，以使本底性的 ATP 全部被消耗掉，從而降低本底?？梢砸淮涡园?10-20 個技術(shù)孔或技術(shù)管分別加上 100μl 酶工作液，從而節(jié)省時間。

2、在技術(shù)孔或技術(shù)管內(nèi)加上 20 微升樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用槍(微量移液器)混勻，至少間隔2 秒后，用 Luminometer 或液閃儀測定 RLU 值或 CPM。

3、為了消除樣品制備時由于蛋白量的差異而造成的誤差，可以用南京建成生產(chǎn)的蛋白濃度

測定試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。然后把 ATP 的濃度換算成 nmol/mg 蛋白的形式。

七、注意事項(xiàng)：

1、酶貯備液中含有熒光素酶，反復(fù)凍融會導(dǎo)致其逐漸失活。建議使用時的凍融次數(shù)不宜超

過 3 次。酶貯備液稀釋成酶工作液后，務(wù)必一次用完，不宜凍存后再使用。

2、ATP，特別是裂解后樣品中的 ATP 在室溫不太穩(wěn)定，需在 4℃或冰上操作。ATP 在冰上可以穩(wěn)定達(dá) 6 小時。

3、本試劑盒需使用化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)。如果沒有化學(xué)發(fā)光儀，也可以使用液閃儀。

液閃儀的測定效果取決于其技術(shù)靈敏度和技術(shù)精度。4、測定之前建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，樣品的體積可以自行在 10-100μl 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。如果樣品中的ATP 濃度比較低，則可以加入 100μl 樣品，如果樣品中 ATP 濃度比較高，則可以加入小體積的樣品，同時標(biāo)準(zhǔn)品也需要使用相同的體積。如果樣品中 ATP 的濃度特別高，可以用裂解液稀釋樣品后再測定。

5、使用可技術(shù)化學(xué)發(fā)光的多功能酶標(biāo)儀時，所用 96 孔板宜為孔和孔之間不透光的黑板或白板。如使用常規(guī)的透明 96 孔板，需特別注意正確設(shè)置酶標(biāo)儀測定時板子的類型，同時也

可以在技術(shù)孔之間設(shè)置間隔孔，以盡量避免鄰近孔之間的相互干擾。

6、本試劑盒提供的裂解液可以有效裂解并釋放常見的培養(yǎng)細(xì)胞和組織中的 ATP。對于一些

特殊的組織或樣品，如果發(fā)現(xiàn)技術(shù)出來的 ATP 水平顯著低于預(yù)期水平，可以在裂解樣品

后并且在離心前，取部分樣品煮沸 2 分鐘以充分釋放 ATP。煮沸后樣品中的蛋白會變性，

從而會在后續(xù)的離心步驟中被沉淀，因此煮沸的樣品不能用于蛋白濃度測定、SDS-PAGE和 Western 技術(shù)?？梢允褂檬Ｓ嗟牟糠謽悠愤M(jìn)行蛋白濃度測定、SDS-PAGE 和 Western 技術(shù)。

7、本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，

不得存放于普通住宅內(nèi)。

8、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

八、產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、 適用范圍廣，本試劑盒可用于技術(shù)組織、細(xì)胞中 ATP 含量。

2、 靈敏度高，本試劑盒最低可技術(shù) 1nmol/L 的 ATP。

3、 樣本制備簡單，本試劑盒提供了可以用于細(xì)胞和組織裂解的裂解液，簡單裂解后即可用

于 ATP 技術(shù)。無需進(jìn)行高氯酸或TCA抽提，煮沸等繁瑣操作。

4、 穩(wěn)定性高，本試劑盒進(jìn)行了特殊的優(yōu)化設(shè)計(jì)，使技術(shù) ATP 時的化學(xué)發(fā)光非常穩(wěn)定。對于ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的技術(shù)結(jié)果顯示，在開始反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)化學(xué)發(fā)光無明顯下降，開始反應(yīng)后 30 分鐘內(nèi)化學(xué)發(fā)光的下降不超過 10%。

5、 測定多樣性，使用本試劑盒中的裂解液裂解獲得的細(xì)胞或組織樣品，不僅可以用于 ATP

技術(shù)，還可用于技術(shù)蛋白濃度、進(jìn)行 SDS-PAGE 或一些常規(guī)的較易溶解蛋白的 Western技術(shù)。

6、 方便快捷，本試劑盒的使用方便快捷，通常 10-20 個樣品可以在 30-60 分鐘內(nèi)測定完畢。附錄 I ：標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

1 、標(biāo)準(zhǔn)品制備：

冰浴上溶解待用試劑，把 0.5mmol/L 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用裂解液稀釋成 0.01、0.02、0.005、

0.1、0.2、0.5、1、2μmol/L 的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，待測。

2 、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

a、加 100μl 酶工作液到技術(shù)孔內(nèi)。室溫放置 5 分鐘，以使本底性的 ATP 全部被消耗掉，從而降低本底。

b、在技術(shù)孔內(nèi)加上 20μl 標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用微量移液器混勻，間隔 2 秒后，用 Luminometer 測定 RLU 值。

3 、測定結(jié)果：

標(biāo)準(zhǔn)品濃度

(μmol/L)

熒光值 熒光值

0 242 0

0.01 1245 1003

0.02 2252 2010

0.05 4726 4484

0.1 9065 8823

0.2 20873 20631

0.5 49239 48997

1 94893 94651

2 182301 182059

ATP含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

Line(a,b) Robust None

r 2 =0.9993273 DF Adj r

2 =0.99910306 FitStdErr=0.018678134 Fstat=10398.769

a=-0.0089349423

b=1.0920521e-05

0 50000 1e+05 1.5e+05 2e+05

2 2

1.75 1.75

1.5 1.5

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/L)

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/L)

1.25 1.25

1 1

0.75 0.75

0.5 0.5

0.25 0.25