穩(wěn)定細胞株構(gòu)建

穩(wěn)定細胞株構(gòu)建服務： 
構(gòu)建穩(wěn)定細胞系的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標志進行篩選。常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418來代替新霉素進行選擇性篩選，篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白，或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。

穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建周期長、難度大，每一步都很關(guān)鍵，尤其是細胞轉(zhuǎn)染，常用物理方法（電轉(zhuǎn)）、化學方法（脂質(zhì)體等）、生物方法（病毒），根據(jù)不同的實驗條件，選擇好的方法，來達到實驗目的。

康佰生物在穩(wěn)定細胞株構(gòu)建上擁有豐富的經(jīng)驗，熟悉每一步操作，尤其對關(guān)鍵步驟有獨到的經(jīng)驗，成功為眾多科研客戶構(gòu)建目的細胞株（過表達、可誘導過表達、沉默、可誘導沉默、報告基因等等）。

蛋白過表達：

目的蛋白的過表達往往是研究該基因/蛋白功能的常規(guī)手段，也是借助表達系統(tǒng)富集蛋白（DHFR、GS system）的方法。蛋白過表達穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建能很好的幫助研究這個蛋白，或者得到大量的目的蛋白。

康佰生物提供的蛋白過表達穩(wěn)定細胞株構(gòu)建服務借助于真核表達載體/慢病毒系統(tǒng)，構(gòu)建含有目的基因CDS的質(zhì)粒/病毒，通過轉(zhuǎn)染/感染在各種細胞基因組上整合目的基因，利用抗生素篩選，得到穩(wěn)定表達的高拷貝克隆，經(jīng)過32代的穩(wěn)定性QC檢測，完成穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建工作。

主要包含如下步驟:

1. 載體構(gòu)建（表達質(zhì)粒載體、病毒載體）；

2. 轉(zhuǎn)染/感染；

3. 目的蛋白初步檢測；

4. 抗生素篩選；

5. 目的蛋白再次檢測（定性/半定量）；

6. 單克隆細胞株穩(wěn)定性檢測。

特殊的過表達蛋白/細胞，請事先咨詢。

蛋白沉默：

目的蛋白的沉默（knock-down or knock-out）往往是研究該基因/蛋白功能的常規(guī)手段,蛋白沉默后細胞表型的檢測是科研的金標準方法。

康佰生物提供的蛋白沉默穩(wěn)定細胞株構(gòu)建服務借助于真核表達載體/慢病毒系統(tǒng)，構(gòu)建含有沉默目的基因（shRNA/microRNA）的質(zhì)粒/病毒，通過轉(zhuǎn)染/感染在各種細胞基因組上整合沉默基因，利用抗生素篩選，得到高效沉默的克隆，經(jīng)過32代的穩(wěn)定性QC檢測，完成穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建工作。

主要包含如下步驟:

1. 載體構(gòu)建（沉默質(zhì)粒載體、病毒載體）；

2. 轉(zhuǎn)染/感染；

3. 目的蛋白初步檢測；

4. 抗生素篩選；

5. 目的蛋白再次檢測（定性/半定量）；

6. 單克隆細胞株穩(wěn)定性檢測。

特殊的過表達蛋白/細胞，請事先咨詢。

誘導系統(tǒng)：

外源蛋白的誘導表達/沉默能很好比較本底和干預的區(qū)別，非常有力的詮釋目的基因/蛋白的作用機理，特別適合研究自身具有毒性的蛋白，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛使用。

康佰生物提供可誘導蛋白表達/沉默穩(wěn)定細胞株構(gòu)建服務借助于真核表達載體/慢病毒系統(tǒng)，構(gòu)建含有“開關(guān)”控制表達/沉默目的基因的質(zhì)粒/病毒，通過轉(zhuǎn)染/感染在各種細胞基因組上整合載體，利用抗生素篩選，得到可誘導的穩(wěn)定細胞株，經(jīng)過32代的穩(wěn)定性QC檢測，完成穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建工作。

主要包含如下步驟:

1. 載體構(gòu)建（誘導質(zhì)粒載體、病毒載體）；

2. 轉(zhuǎn)染/感染；

3. “開關(guān)”誘導下目的蛋白初步檢測；

4. 抗生素篩選；

5. “開關(guān)”目的蛋白再次檢測（定性/半定量）；

6. 單克隆細胞株穩(wěn)定性檢測。

特殊的過表達蛋白/細胞，請事先咨詢。

服務說明:

1. 穩(wěn)定細胞株構(gòu)建依據(jù)目的不一樣，方案差異非常大，成功率差異也很大，本著對客戶負責的態(tài)度，建議事先咨詢，并且安排預實驗；

2. 客戶可以提供基因序列、載體、細胞，也可以查找本公司模板庫、載體庫、細胞庫，也可以由我們公司代購；

3. 本服務僅對目的基因的表達、穩(wěn)定性做保證，不涉及基因功能，具體基因功能檢測，需要另外評估和收費；

提交的產(chǎn)品和資料:

1. 構(gòu)建好的質(zhì)粒（4ug）/病毒(1ml)，含目的基因序列/沉默序列/誘導序列；

2. 穩(wěn)定細胞株2管；

3. 實驗報告。