（C/N: CE201） iElisa 黃曲霉毒素 B1 檢測試劑盒

iElisa 黃曲霉毒素 B1 檢測試劑盒

iElisa 黃曲霉毒素 B1 檢測試劑盒

1. 概要 黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的有毒的代 謝產物，主要存在于谷物、堅果和飼料中。1993 年 黃曲霉毒素 B1 被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研 究機構劃定為Ⅰ類致癌物，是一類毒性*的劇毒 物質。它被證明對人和動物的肝臟、腎臟等組織和 器官具有很大的危害。中國標準規(guī)定：黃曲霉毒素 B1 在玉米、大米、小麥中*分別不得超過 20、 10、5μg/kg，各種飼料中黃曲霉毒素 B1 的*標 準為 10-50μg/kg。 2. 原理 測定的基礎是抗原-抗體反應。微孔板上包被有 抗抗體。加入黃曲霉毒素 B1（AF-B1）標準品或樣 品、酶標抗原和抗體后，游離的黃曲霉毒素 B1 與 酶標抗原競爭結合抗體，抗體或抗體結合物與固定 在微孔板上的抗抗體再結合，沒有結合的標準品、 酶標抗原及抗體被洗去，加入 TMB 底物顯藍色， 加入終止液后顏色由藍變黃，用酶標儀在 450nm 處 檢測，吸光值與樣品中黃曲霉毒素 B1 含量成負相 關，與標準曲線比較即可得出黃曲霉毒素 B1 的含 量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12條 ×8 孔） 2) 黃曲霉毒素B1標準品：0 ng/ml、0.1 ng/ml、 0.3ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml 4.0ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) AF-B1酶標抗原 1 瓶 ×10ml 4) AF-B1抗體 1 瓶 ×10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) AF-B1稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) AF-B1稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說明書： 1 份 11) 質檢報告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標儀 450nm（iElisa 全自動酶標儀或相當者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉混合器（或者搖床、高速均質器） —酶標板振蕩器 —渦旋混合器 —氮氣吹干儀 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —離心機 —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 —純水（蒸餾水、去離子水）、正己烷、三氯甲烷、 甲醇 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 將提取液用普通濾紙過濾，吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩 沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數：12.5 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質器均 質 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過濾，用 0.22μm 有機系 濾膜過濾后，取 100μl 濾液置于 1.5ml 離心管 中，加入 500ul AF-B1 稀釋緩沖液 B，用渦旋 混合器混勻。 稀釋倍數：305.3 植物油 1）稱取 2.5g 油樣品，加入 10mL 樣品提取液（70% 甲醇水），劇烈振蕩 3min（用手或振蕩器），或 搖床震蕩 10min。 2） 將提取液用普通濾紙過濾。吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩 沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數：10 倍 5.4 醬油、醋： 1） 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2） 4000 轉離心 5 分鐘，取下層三氯甲烷溶液 5ml 與氮氣吹干儀（60℃）吹干。加入 4ml 70%甲 醇水渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復溶。 3） 吸取 200μl 復溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數：10 5.5 糕點： 1） 取 5.0g 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 70% 甲醇水置于多功能旋轉混合器上振蕩 10 分鐘 （或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上振 蕩 40 分鐘）。 2） 定性濾紙過濾，取濾液 5ml 加入 10ml 三氯甲烷 渦旋 1min,4000 轉離心 5 分鐘，取下層澄清三 氯甲烷溶液 5ml 與氮氣吹干儀（60℃）吹干。 加入 2ml 70%甲醇水渦旋混勻 1 分鐘，使其充 分復溶。 3） 吸取 200μl 復溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數：10 5.6 酒類（白酒、啤酒、威士忌、櫻桃酒、葡萄酒 等） 1) 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2) 3000 轉離心 5 分鐘，取上層澄清溶液 5ml 于氮 氣吹干儀（60℃）吹干。加入 5ml 70%甲醇水 渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復溶。 3) 吸取 200μl 復溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數：12.5 5.7 發(fā)酵液： 1) 吸取 40μl 液體樣品置于 1.5ml 離心管中 2) 加入 960μl AF-B1 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合 器混勻。 稀釋倍數：25 5.8 尿液樣品： 1) 取 5ml 待檢樣品于 15ml 離心管中，3000r/min， 離心 10 分鐘 2) 吸取 100μl 離心后澄清樣品置于 1.5ml 離心管 中 3) 加入 400μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合 器混勻。 稀釋倍數：5 5.1 豆瓣醬等： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過濾，吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩 沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數：12.5 6． 酶聯免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。 4) 所有溫育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根據實驗所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測）。 6.3 測定程序 1) 將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄 下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標準品或樣品分別加至相應的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl AF-B1 酶標抗原， 再加入 50μl AF-B1 抗體，加蓋，在室溫溫育 20 分鐘（每個標準品和樣品必須使用新的吸 頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μl顯色底物TMB，室溫避光溫育 10分鐘。 5) 每孔加入50μl 終止液。 6) 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結果判定 1）所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的 平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以黃曲霉毒素 B1 標準品濃度值（ppb）為 X 軸， 百分吸光度值為 Y 軸，繪制標準曲線圖。相對應每 一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用 回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專 業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實際濃度為讀數結果乘以相應稀釋倍 數。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進行稀釋。 8. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導致數值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現板孔干燥過久的情況， 則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現 象。所以洗板排干后應立即進行下一步操作。 3) 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結果不 準確。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標 1) 檢測限 LOD: 谷 物 0.6ppb(μg/kg) ， 飼 料 1.8ppb(μg/kg)，植物油 0.6ppb(μg/kg)，醬油、 醋 0.6ppb(μg/kg)，糕點 0.6ppb(μg/kg)，酒類 0.6ppb(μg/kg),發(fā)酵液 1.5ppb(μg/kg)，尿液類 0.3ppb(μg/kg)，豆瓣醬 1.0ppb。（LOD：空白樣 品測定值+2 倍標準偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷 物 1.25ppb(μg/kg) ， 飼 料 3.0ppb(μg/kg)，植物油 1.0ppb(μg/kg)，醬油、 醋 1.0ppb(μg/kg)，糕點 1.0ppb(μg/kg)，酒類 1.25ppb(μg/kg),發(fā)酵液 2.5ppb(μg/kg)，尿液類 0.5ppb(μg/kg)，豆瓣醬 2.0ppb。 3) 定 量 檢 測 范 圍 ： 谷 物 1.25-50ppb ， 飼 料 3.0-120ppb ，植物油 1.0-40ppb ， 醬 油 、 醋 1.0-40ppb，糕點 1.0-40ppb，酒類 1.25-50ppb, 發(fā)酵液 2.5-100ppb, 尿液類 0.5ppb-20ppb，豆瓣 醬 2.0-50ppb。