AC15L343 Collagenase, TypeⅣ 膠原酶Ⅳ型

產(chǎn)品描述
　　消化法中常使用的酶有3種：胰*白酶、膠原酶以及透明質(zhì)酸酶，透明質(zhì)酸酶多數(shù)情況下與胰*白酶或膠原酶聯(lián)合應(yīng)用。胰*白酶作用較強(qiáng)，容易造成平滑肌細(xì)胞損壞，而膠原酶作用較緩和，能消化細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維以釋放細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞損傷小，是一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶。
　　膠原酶(Collagenase)從溶組織梭菌（Clostridium histolyticum）提取的一種酶粗提物，也叫梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A），不僅含有膠原酶，還含有其他的一些蛋*酶、多糖酶、脂酶等。這些成分分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白，多糖和脂質(zhì)。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，既操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率，終濃度200u/mL，此酶消化作用緩和，無(wú)需機(jī)械振蕩。
　　目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為四種類(lèi)型：膠原酶I型，II型，III型和IV型，在應(yīng)用上有所偏向：(1)膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋*酶活性）。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備。(2)膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來(lái)源細(xì)胞的制備。(3)膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋*酶活性，常用于乳腺細(xì)胞的制備。(4)Collagenase, TypeⅣ 膠原酶Ⅳ型含有低胰*活性，通常用于胰島細(xì)胞的制備，或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。
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保存方法
  4℃保存，保質(zhì)期一年。
使用方法
1. 膠原酶儲(chǔ)存液的配制
向每管100 mg的膠原酶中加入100 μL的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS（Hank’s平*鹽溶液，含Ca²⁺、Mg²⁺），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1 g/mL（即1000×）的儲(chǔ)存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。
使用前于冰上解凍，避免反復(fù)凍融。其用于組織和細(xì)胞分散的常用濃度為：0.5~2.5 mg/mL，用于軟骨消化的常用濃度為1~2 mg/mL，需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件或者參考相應(yīng)的文獻(xiàn)資料確定所需的合適的工作濃度。
2．組織的分離
（1）使用無(wú)菌shoushu刀或剪刀將組織切成3~4 mm大小的組織塊。
（2）利用含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS洗滌組織塊數(shù)次。
（3）加入足量的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS，使其浸沒(méi)組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度。
（4）于37℃孵育4~18 h。消化時(shí)使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補(bǔ)充消化可以提高消化效率。
（5）已分散開(kāi)的細(xì)胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得，收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育。
（6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次。
（7）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞，利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。

（8）于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。
3．器官灌注
（1）向37℃預(yù)熱的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS中加入膠原酶，另添加3 mM的CaCl₂有助于提高分離效率。
（2）按照已優(yōu)化的速率對(duì)相應(yīng)的器官灌注膠原酶工作液。
（3）將上述過(guò)程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩，從而將已解離的細(xì)胞或小片段組織塊與較大團(tuán)塊分離開(kāi)來(lái)，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進(jìn)一步孵育。
（4）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次。
（5）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞，利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。
（6）于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。
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