腫瘤細胞凋亡

一、 細胞凋亡的形態(tài)學檢測
1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡
(1)未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
(2)染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形
2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡 的進展情況。常用的DNA特異性染料有: HO 33342 (Hoechst 33342) , HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋,終濃度為10 ug/ml。DAPI為半通透性,用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度-般為10 ug/ml。結(jié)果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期: I期的細胞核呈波紋狀( rippled )或呈折縫樣( creased ),部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài) ; I a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;I b期的細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小。

3、透射電子顯微鏡觀察
結(jié)果評判:凋亡細胞體積變小,細胞質(zhì)濃縮。凋亡I期( pro-apoptosis nuclei )的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞,出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象( cavitations )的空泡結(jié)構(gòu) ; I a期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體。
二、磷脂酰絲氨酸外翻分析( Annexin V法)
磷脂酰絲氨酸( Phosphatidylserine, PS )正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè),但在細胞凋亡的早期, PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面,暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一 種分子量為35~ 36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE )或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。