光譜儀和分光光度計(jì)

儀器概況

       光譜儀（spectrometer）和分光光度計(jì)（Spectrophotometer）,是將成分復(fù)雜的光分解為光譜線的科學(xué)儀器。

       當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱，因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?，一部分?被組成此溶液的物質(zhì)所吸收，只有一部分光可透過(guò)溶液。因此：

入射光=反射光+分散光+吸收光+透過(guò)光。

如果我們用蒸餡水（或組成此溶液的溶劑）作為“空白”去校正反射，分散等因素造成的入射光的損失，則 出現(xiàn)：

入射光=吸收光十透過(guò)光。

        不同的光源都有其發(fā)射光譜，因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。不同物質(zhì)都有特定的吸收光譜，根據(jù)溶液的吸收光譜，可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)成分。

        鈣燈發(fā)射光譜：鴇燈光源所發(fā)出380?780nm波長(zhǎng)的光譜光通過(guò)三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、 藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜，該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源。

        氫燈（或笊燈）發(fā)射光譜：氫燈（或気燈）能發(fā)出185-400nm波長(zhǎng)的光譜，可作為紫外光光度計(jì)的光源。

常用的波長(zhǎng)范圍包括：

（1）     200?380nm的紫外光區(qū)；

（2）     380~780nm的可見(jiàn)光區(qū)；

（3）     2.5?25卩m （按波數(shù)計(jì)為4000/®米?400/厘米）的紅外光區(qū)。

       用于測(cè)量200?380nm的紫外光區(qū)物質(zhì)吸光度的儀器為紫外分光光度計(jì)；

       用于測(cè)量380?780nm的可見(jiàn)光區(qū)物質(zhì)吸光度的儀器為可見(jiàn)光分光光度計(jì)（或比色計(jì)）：

       用于測(cè)量2.5?25〃 m （按波數(shù)計(jì)為4000/厘米?400/厘米）的紅外光區(qū)物質(zhì)吸光度的儀器為紅外分光光度計(jì) 或原子吸收分光光度計(jì)。

工作原理

       光譜儀和分光光度計(jì)釆用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源， 光線透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光線被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品 的濃度成正比。

       單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液吋，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比， 其關(guān)系如下式：

A=-lg（I/Io）=-lgT=kLc

式中：A為吸光度：Io為入射的單色光強(qiáng)度；1為透射的單色光強(qiáng)度：T為物質(zhì)的透射率；k為摩爾吸收系數(shù); L為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(zhǎng)；c為物質(zhì)的濃度；

儀器用途

1.    核酸的定量

       核酸定量是紫外光譜儀和紫外分光光度計(jì)使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核昔酸，單鏈、 雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm。

        除了核酸濃度，光譜儀和分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值， 用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nmo

       純凈的樣品，比值大于1.8 （DNA）或者2.0 （RNA）。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類 物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比 值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

2.    蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

       這種方法是在280nm波長(zhǎng)直接測(cè)試蛋白，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法, 將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存 在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息。

3.    比色法蚩白質(zhì)定量

       蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸） 與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反映的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而 反映蛋白質(zhì)濃度。比色方法一般有BCA、Bradford、Lowry等兒種方法。

4.    細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）

       實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要 釆用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng) 液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。

5.    海洋學(xué)研究中痕量物質(zhì)濃度

       WPI公司設(shè)計(jì)長(zhǎng)光程液態(tài)樣本流通池（LWCC）具有50、100、250和500不同的光程可以選擇。因此，不同 光程長(zhǎng)度的LWCC配合適的光源和檢測(cè)器，常用于海洋學(xué)應(yīng)用中營(yíng)養(yǎng)物分析的流體注射分析系統(tǒng)（如硝酸鹽、 亞硝酸鹽、磷酸鹽和鐵離子檢測(cè)等）。海水和淡水中CDOM （有色溶解有機(jī)物含量）的檢測(cè)，因?yàn)楹Ｋ蠧DOM的 含量極低（0.007m-l）。

6.    大氣環(huán)境中超低含量物質(zhì)濃度

      大氣中的SO2、硝酸鹽、亞硝酸鹽、羥基、棕碳、黑碳、水溶性鐵、氣溶膠等含量很低，使用普通的分光光 度計(jì)很難檢測(cè)出來(lái)。將大氣中釆集的樣本液態(tài)化，再配合不同光程的LWCC進(jìn)行檢測(cè)，可以將這些含量極低的 物質(zhì)加以檢出。