AX-S019 雙熒光素酶實驗

實驗概念

將目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件構(gòu)建入帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達(dá)載體，構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒，使這段序列調(diào)控luciferase的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。然后將報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，給予其不同的處理后裂解細(xì)胞，并加入底物熒光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin發(fā)出熒光(強(qiáng)波長在560nm左右)。檢測得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對該轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件的影響。為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時效率差異所造成的誤差，通常會轉(zhuǎn)入Renilla luciferase的報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參(強(qiáng)波長在465nm左右)，即雙熒光報告系統(tǒng)。

實驗流程

（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

（2）設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。

（3）篩選陽性克隆，測序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。

（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。

（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。

（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較。

注意事項：需提前告知相關(guān)的基因信息，如名稱、序列、ID等