BrdU熒光染色

BrdU熒光染色檢測原理

用BrdU預(yù)處理的細(xì)胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并帶到子代細(xì)胞中。細(xì)胞經(jīng)過固定和變性處理后，可用免疫學(xué)方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識(shí)別BrdU,再采用辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗標(biāo)記，最后用比色法或熒光的方法進(jìn)行定量測定)，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。

BrdU熒光染色實(shí)驗(yàn)步驟

1.細(xì)胞以1.5×105 /ml細(xì)胞數(shù)接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿中(內(nèi)放置一蓋玻片)，培養(yǎng)1 d，用含0.4%FBS培養(yǎng)液同步化3 d，使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期。

2.加入BrdU(儲(chǔ)液：1.0 mg/ml,終濃度為0.03 μg/ml)，37℃，孵育40min。

3.棄培養(yǎng)液，玻片用PBS洗滌3次。

4.甲醇/醋酸固定10 min。

5.經(jīng)固定的玻片空氣干燥，0.3%H2O2-甲醇30 min滅活內(nèi)源性氧化酶。

6.5%正常兔血清封閉。

7.甲酰胺100℃，5 min變性核酸。

8.冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1：50)，陰性對(duì)照加PBS或血清。

9.按ABC法進(jìn)行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算標(biāo)記指數(shù)(LI)。

注意事項(xiàng)

1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml雙蒸水，4℃下避光保存

2.BrdU會(huì)肌體造成不可逆損傷，使用時(shí)注意安全，避免吸入BrdU粉塵。