分子克隆與質(zhì)粒載體構(gòu)建

一、實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復(fù)合物；然后，酶—AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。

連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

二、實驗流程

目的DNA的擴增和純化；

連接反應(yīng)；

電泳檢測連接產(chǎn)物。

三、客戶提供

樣本DNA，基因序列，試劑盒。

四、公司提供

構(gòu)建好的載體，電泳膠圖，測序結(jié)果。

實驗周期：大約1-2月。