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1、沒有產(chǎn)物

?   遺漏了PCR試劑，重復PCR反應，但要進行核對，以確保所有成分都加入。

?   引物設計不良，重復引物設計過程，再次檢查引物特異性，嘗試增加引物長度，或采用不同的設計方法。在文獻或數(shù)據(jù)庫中搜索能擴增預期DNA片段的有效引物。

?   引物不足，確認引物儲備準備正確。通過改變引物的濃度來重復測試；通常的范圍是0.05 ~ 1 μM。

?   引物質量差，引物可能是舊的或退化的。用納米滴定儀檢查其質量，用新鮮引物替換。

?   模板質量差，用凝膠電泳分析質粒，用納米滴管的A260/280比率分析質粒和gDNA，以評估其質量。進一步純化模板DNA。

?   復雜模板，除非使用特殊的聚合酶，否則從富含GC的片段或較長的模板進行擴增可能是次優(yōu)的[7]。模板濃度在質粒（每50μL反應1pg10 ng）和gDNA（每50μL反應1 ng-1μg）之間的擴增有所不同。

?   次優(yōu)的鹽條件，鎂陽離子（Mg2+）作為聚合酶的輔助因子；因此，低鎂鹽水平會降低聚合酶的活性。用不同的鎂鹽濃度進行一系列測試PCR反應，以確定水平。另外，在解凍鎂鹽儲備時要渦旋，以重新懸浮儲存時沉淀的任何鹽。

?   存在反應抑制物或污染物，進一步純化模板DNA，高壓滅菌PCR管，或使用新鮮試劑。

?   循環(huán)不足，用不同的循環(huán)進行測試PCR反應，以確定理想的數(shù)量。

?   延伸時間不足，如果沒有給聚合酶足夠的時間來擴增DNA，那么就不會有產(chǎn)物。核實制造商的聚合酶速率，并計算出足夠長的延伸時間，以使DNA得到擴增。

?   不正確的PCR程序，檢查是否使用了正確的程序，或者正確的程序沒有被無意中改變。核實PCR程序并重復PCR反應。

?   退火溫度不正確，退火溫度可能太高。檢查所設計的引物的預期Tm，通過使用退火溫度梯度進行測試。

?   退火時間不正確，退火時間可能太短；沒有給引物足夠的時間與模板結合。

?   阻斷溫度不正確，如果阻斷溫度不正確，退火、延伸和熔化溫度將不準確。為了糾正，請進行加熱塊校準。

2、結果微弱

?   引物不足，引物質量差，模板質量差，模板復雜，鹽條件不理想，存在反應抑制劑或污染物，循環(huán)不足。

?   脫氧核苷三磷酸酯（dNTPs）降解，dNTPs可能因反復凍融循環(huán)而降解。等分庫存以減少降解。

?   不正確的變性溫度，變性溫度可能太低；模板融化不理想，導致擴增效率低。

?   不正確的變性時間，變性持續(xù)時間可能太短；沒有給模板足夠的時間熔化，導致擴增效率低。

3、不正確或非特異性產(chǎn)物

?   引物設計不正確，引物沒有設計成能擴增所需的DNA片段，導致產(chǎn)物大小不正確。重新設計引物以擴增正確的片段。當出現(xiàn)非特異性條帶時，增加引物長度以加強模板結合，盡量減少錯誤引物。

?   引物缺乏特異性，檢查引物在模板DNA中是否有額外的互補區(qū)域。

?   引物過量，檢查確定引物儲備的制備是否正確。通過改變引物濃度來重復試運行；通常的范圍是0.05-1μM。

?   模板濃度不正確，從質粒（每50μL反應1pg-10ng）到gDNA（每50μL反應1ng-1μg）的擴增，模板濃度不同。檢查模板濃度并調整PCR反應的體積。運行測試反應以確定濃度。

?   次優(yōu)的鹽條件，鎂離子可增強引物與模板結合的穩(wěn)定性，增加引物與不互補的模板序列的親和力。用不同的鎂鹽濃度進行一系列的測試PCR反應，以確定水平。另外，在解凍鎂鹽漿時，渦旋，以重新懸浮任何可能在儲存時沉淀的鹽。

?   不正確的退火溫度，如果退火溫度太低，可能會發(fā)生誤吸，導致大小不一的條帶。

?   不正確的退火時間，退火時間可能太長；使引物有更多的時間與模板發(fā)生誤植。

?   過早復制，在冰上準備PCR反應，使用熱啟動聚合酶，并將PCR機預熱到變性溫度。

?   外源性DNA的污染，使用新鮮試劑，在專門的凈化區(qū)工作。

?   核酸酶污染，使用新鮮試劑重復PCR反應。

4、序列錯誤

?   低保真聚合酶，低保真度的聚合酶比高保真度的聚合酶更頻繁地發(fā)生復制錯誤。

?   循環(huán)次數(shù)太多，不必要的循環(huán)會增加聚合酶出錯的可能性。進行測試反應以確定所需的最小循環(huán)次數(shù)。

?   不理想的鹽條件，降低PCR反應中的鎂鹽濃度。

?   降解或不平衡的dNTPs濃度，等分dNTP儲備以減少凍融循環(huán)造成的降解；確保儲備中含有等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。PCR反應的dNTP含量可能過高，用較低的濃度測試反應條件。

?   模板質量差，模板可能在純化過程中被剪切或缺口，或因紫外線照射而損壞。準備新鮮模板并重復PCR反應。

?   降解的PCR產(chǎn)物，如果PCR產(chǎn)物在凝膠中切除條帶之前在紫外光下被成像，那么它可能被損壞。重復PCR反應，但要限制紫外線照射，并加快工作速度以切除條帶。