熒光素酶檢測(cè)

1. 熒光素酶的種類

  螢火蟲熒光素酶：這是常用的一種熒光素酶，通過催化底物氧化發(fā)光，顏色為黃綠色，波長(zhǎng)約550-570nm。

  海腎熒光素酶：這種熒光素酶產(chǎn)生的光顏色為藍(lán)光，波長(zhǎng)約為480nm。它常與螢火蟲熒光素酶一起用于雙熒光素酶報(bào)告中。

2. 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的基本原理

  共價(jià)結(jié)合：轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域與順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)作用。

  熒光素酶活性測(cè)定：將感興趣的基因調(diào)控元件插入熒光素酶基因前方，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如果轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，熒光素酶基因就

                                會(huì)表達(dá)，通過測(cè)定熒光素酶活性可以判斷轉(zhuǎn)錄因子與靶啟動(dòng)子片段的作用強(qiáng)度。

3. 優(yōu)點(diǎn)

  高靈敏度：靈敏度非常高，比Western blotting方法高1000倍以上。

  低內(nèi)源性表達(dá)：哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒有內(nèi)源性熒光素酶表達(dá)，因此檢測(cè)結(jié)果非常特異。

  操作簡(jiǎn)便：相比其他生物學(xué)檢測(cè)方法，操作更為簡(jiǎn)便，并且可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選。

4. 應(yīng)用領(lǐng)域

  啟動(dòng)子分析：通過構(gòu)建不同的啟動(dòng)子突變體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后測(cè)定熒光素酶活性，可以分析啟動(dòng)子的活性及其調(diào)控元件。

  藥物篩選：利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)可以進(jìn)行藥物對(duì)特定信號(hào)通路的影響分析，如核受體藥物篩選。

  microRNA 靶標(biāo)驗(yàn)證：通過將待測(cè)mRNA的3’UTR序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入相應(yīng)的microRNA，觀察熒光素酶活性的變化來驗(yàn)證microRNA與

                                    靶標(biāo)的互作。

5. 注意事項(xiàng)

  溫度控制：由于酶反應(yīng)受溫度影響，測(cè)定時(shí)樣品和試劑需達(dá)到室溫。

  避免反復(fù)凍融：為試劑的穩(wěn)定性，應(yīng)適當(dāng)分裝后避光保存。

  內(nèi)參校正：使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)時(shí)，通常將海腎熒光素酶作為內(nèi)參，以減少實(shí)驗(yàn)條件變化對(duì)結(jié)果的影響

      綜上所述，熒光素酶檢測(cè)作為一種高效、靈敏的分子生物學(xué)工具，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物篩選等研究領(lǐng)域。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)具體研究