AFLP 試劑盒（EcoRI-MseI）

產(chǎn)品簡介：

AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）原理是一種結(jié)合 RFLP 和 PCR 技術(shù)特點的一種分子標記分型技術(shù)，其原理如下：

產(chǎn)品特點：

1.一站式，足夠 50 次酶切-連接反應(yīng)、50 次預(yù)擴反應(yīng)和 1500 次 AFLP PCR（30 μL體系計算），但不包括 DNA 純化和帶型分析試劑（如 PAGE 電泳試劑和銀染試劑）

2.本產(chǎn)品提供 EcoRI-MseI 組合，適用于 GC 含量在 50%以上的基因組。對 GC 含量在 50%以下的基因組，需從本公司另外采購 EcoRI-TaqI 組合的 AFLP 試劑盒。

3.各種參數(shù)都經(jīng)過優(yōu)化，一次 PCR 所得 AFLP 片段數(shù)一般在 10-100 之間，可重復(fù)性好，誤差小于 0.6%。

4.本產(chǎn)品適用于基因組在 500 Mb-6000 Mb 的材料（如動物和植物）。對于基因組在 50-500 Mb 的材料（如細菌和真菌）或 50Mb 以下的材料（如質(zhì)粒，cosmid，BAC YAC 和 PAC 等），需要分別另購+0 型預(yù)擴增引物對和+2 型擴增引物。

5.AFLP 試劑盒（EcoRI-MseI）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

AFLP 酶切-連接-預(yù)擴增相關(guān)成分50 次十孔盒

AFLP +3 型 EcoRI 引物系列8 條十孔盒

AFLP +3 型 MseI 引物系列8 條十孔盒

AFLP PCR 成分5 mL×6熱封塑料袋

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

超純水、Southern 級 DNA 純化試劑，尿素-PAGE 電泳套裝，銀染試劑盒。

使用方法：

一、 DNA 提取（本試劑盒不提供相關(guān)試劑）

1.用戶需要自備 50-500ng Southern 級別的基因組 DNA。DNA 酶切徹-底是 AFLP 成功的關(guān)鍵，所以最好先預(yù)實驗以確保 DNA 能夠被 EcoRI 和 MseI 內(nèi)切酶徹-底切開。

二、 限制性內(nèi)切酶酶切和 DNA-接頭連接反應(yīng)（本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的酶切-

連接反應(yīng)）

2.在 0.2mL 離心管中設(shè)置 20μL 的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)：

3.輕柔混勻并短暫離心后，37℃保溫 2 小時酶切（若 PCR 儀器不帶熱蓋，則必須加 50?L自備石蠟油，否則水分會蒸發(fā)影響反應(yīng)。下同）。反應(yīng)結(jié)束后 70℃保溫 15 分鐘滅活酶。

4.在體系中加入 20μL AFLP EcoRI-MseI 接頭混合物和 1μL T4 DNA 連接酶，5U/?L，輕柔混勻并短暫離心，20℃保溫 3 小時讓接頭跟酶切 DNA 片段連接。第一次使用本試劑盒時，需要把本試劑盒提供的 1mL AFLP EcoRI-MseI 接頭溶解液加入到 AFLP EcoRI-MseI 接頭干粉管，渦旋震蕩半分鐘，短暫離心，然后再取用。沒有用完的需要放-20℃保存。

5.反應(yīng)結(jié)束后直接在 40μL 的連接反應(yīng)體系中加入自備 360μL 超純水，得到連接液 10倍稀釋液，直接作為模板用于下步的預(yù)擴增或放-20℃保存待用。

三、 預(yù)擴增（本試劑盒足夠 40 次 30μL 體系的預(yù)擴增反應(yīng)）

6.在 0.2mL 離心管中設(shè)置 30μL 的預(yù)擴 PCR 體系。首-次使用本試劑盒時，需要在本試

劑盒提供的+1 型 EcoRI-MseI 預(yù)擴增引物干粉管中加入 100μL 自備超純水，渦旋震

蕩半分鐘混勻，短暫離心后直接取用。沒有用完的部分，需要放-20℃保存：

7.離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進行 PCR 預(yù)擴增（注意：第一步是預(yù)合成，跟常規(guī) PCR 不同）：預(yù)合成 72℃ 2 分鐘，PCR 循環(huán) 20 次（94℃30S，56℃60S，72℃60S）

8.取 10μL PCR 產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖膠上電泳檢測，產(chǎn)物應(yīng)為大小在 100-1500bp 的模糊條帶。本試劑盒的 2×PCR MasterMix 含上樣液和示蹤染料，故不需要額外加 Loading Buffer。示蹤染料的泳動速度相當于 50bp 的 DNA 片段。

9.在剩下的 20μL 預(yù)擴增反應(yīng)液中加入 980μL 自備超純水，相當于稀釋 50 倍，所得 50倍 PCR 模板稀釋液將直接作為模板用于下步擴增或放-20℃保存待用。

四、選擇性 PCR 擴增

10.制備引物：在本試劑盒提供的 8 只+3 型 EcoRI 引物干粉和 8 只+3 型 MseI 引物干粉中，每管分別加入 1100μL 自備超純水，震蕩混勻得 16 管引物母液。每管取 66μL引物母液與 1034μL 超純水在 1.5mL 離心管中混合得 1100μL 每個引物的相應(yīng)工作液，共 16 管引物工作液。

11.在 0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（第一次 PCR 時需要測試所有 8×8=64 種引物組合，需設(shè)置 64 個 PCR 反應(yīng)。若已知哪個一種或幾種引物組合適合，則可以直接使用選中的引物），下面以一種+3 型 EcoR I 引物和+3 型 Mse I 引物組合為例：

12.輕柔混勻后離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進行 PCR：

溫度時間

PCR

13 次循環(huán)94℃30 秒

65℃30 秒（每次循環(huán)遞減 0.7℃）

72℃60 秒

PCR

23 次循環(huán)94℃30 秒

55℃30 秒

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