17-0891-01 Percoll細(xì)胞分離液（Pharmacia）

Percoll細(xì)胞分離液（Pharmacia） Percoll細(xì)胞分離液（Pharmacia） 

Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞
（一）原理
Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20mosm／kg H２O）, 粘度也很小，可形成高達(dá)1.3g／ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力（200～1000g）于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。
（二）操作方法及注意事項(xiàng)
1.不同濃度（密度）Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。
Percoll濃度（％）　 70　     　60　     50　     40　      30　　  20
比重g／ml　          1.090      1.077      1.067    1.056     1.043     1.031
 2.不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤(rùn)，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過(guò)程中一般用長(zhǎng)針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí)，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
 3.裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過(guò)大，細(xì)胞濃度也不可過(guò)高，否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。
 4.離心：一般采用離心力為400g，時(shí)間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢，要平穩(wěn)。
 5.取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時(shí)，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測(cè)用。

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