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【ISCO】反相RediSep®柱在肽分離中的應(yīng)用與優(yōu)化
檢測樣品:多肽
檢測項目:分離 純化
方案概述:本文介紹了使用反相RediSep?柱進行肽分離的有效方法。通過選擇合適的柱和初始條件、優(yōu)化移動相和檢測波長、添加反離子以及建立合適的梯度,可以實現(xiàn)高效的肽分離。文章還提供了具體的操作技巧和參數(shù)調(diào)整建議,以幫助研究人員在生物化學(xué)研究中提升肽分離的效率和效果。
一、應(yīng)用概述
肽可以被定義為氨基酸的短鏈聚合物。單個肽的特性當(dāng)然取決于其特定的氨基酸組成和排列方式。肽具有相對的極性,其結(jié)合特性與其他蛋白質(zhì)相當(dāng)一致。
肽混合物可以被分離成單個肽種類。如果可以將這些單獨且更具體的肽包含在一個單一的餾分中,這將極大地加速許多科學(xué)過程。
以下是一個通用的方法,用于在可重復(fù)使用的反相RediSep® C18柱上將肽混合物分離成餾分。
通常最好從4.3克的RediSep反相柱開始。在探索特定肽的良好參數(shù)時,會使用較少的肽樣品和溶劑。一旦確定了洗脫參數(shù),就可以根據(jù)需要擴大過程規(guī)模?;仡櫡聪嗬碚摰膽?yīng)用說明AN10可能是有益的。
對于本參考文獻中使用的特定肽混合物,參數(shù)列于表1中。參數(shù)將隨肽結(jié)構(gòu)而變化。
表格1:通用方法參數(shù)
二、通用方法波長
理想的波長會根據(jù)肽的結(jié)構(gòu)而變化。選擇具有最高靈敏度的波長是理想的,同時避免引入過多噪聲或遺漏某些化合物。如果210 nm過于嘈雜,那么214 nm通常會提供一個更干凈的基線。環(huán)狀結(jié)構(gòu)在280 nm處吸收最好,雙鍵在254 nm處,單鍵在210 nm處。推薦的通用波長對于蛋白質(zhì)和肽是210 nm。
反離子
為了提高肽和柱的性能,通常使用反荷離子。這有助于提供更均勻的分離,從而改善柱性能。常用的反荷離子是0.1%(體積比)三氟乙酉夋(TFA)。將其等量添加到A和B移動相中。在整個分離過程中保持穩(wěn)定反荷離子濃度會得到更一致的基線。簡單的配制方法是每升移動相中加入1毫升(0.1% v/v)。直接用移液管將TFA加入到移動相中并彳切底混合。
柱負載
這個參數(shù)根據(jù)肽的組成有很大的變化。對于4.3克的RediSep反相柱,0.5毫克應(yīng)該是一個好的起點。
柱構(gòu)造
柱本身由三個主要部分組成:
1. 支持介質(zhì)是固定相所綁定的固體表面。
2. 固定相是附著在支持介質(zhì)上的活性涂層,即C18。
3. 移動相是流過支持介質(zhì)的流體,以便將肽的活性部分暴露給固定相。
移動相或溶劑系統(tǒng)
許多肽強烈地吸附在C18上,通常需要一個強梯度來洗脫。典型地,水用作溶劑A,乙腈用作溶劑B來洗脫肽。
梯度
在建立新方法時,通常建議創(chuàng)建一個從0到95% B溶劑的非常緩慢的梯度,以確保所有峰都被洗脫并且柱子被清潔。
在初始的0-95%梯度運行后,洗脫輪廓大致確定,可以根據(jù)特定肽的需要修改梯度。通過在特定的保留時間改變梯度的斜率,可以優(yōu)化分離時間和峰形。
三、分析結(jié)果
圖1提供了一個參考肽的色譜圖。特定的肽是使用表1中列出的參數(shù)進行分離的。參數(shù)將隨著肽的結(jié)構(gòu)而變化。
圖1:樣品肽色譜圖
四、總結(jié)
肽的純化方法可以先在較小的柱上建立,然后根據(jù)所需的樣品負載量進行放大。
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