摘要：本文旨在介紹一種基于ICH Q14指南的有關物質分析方法開發(fā)流程，該方法利用ACD/AutoChrom 軟件和統(tǒng)計學工具來開發(fā)HPLC分析方法和驗證分析方法的耐用性范圍。通過案例研究某主成分及其雜質的分析，展示了如何確保方法的專屬性、準確度和靈敏度及確定合理的耐用性范圍。
引言
在藥物開發(fā)過程中，有關物質的分析是確保藥品質量的關鍵步驟。ICH Q14指南提供了一個關于方法開發(fā)的框架，要求分析方法必須滿足專屬性、準確度和靈敏度等要求。本文通過某主成分的案例，詳細描述了按照ICH Q14要求如何利用ACD / AutoChrom 軟件和統(tǒng)計學方法來開發(fā)和驗證HPLC分析方法。
方法開發(fā)范圍及目的
目的：某主成分是一種原料藥，本研究旨在開發(fā)一種分析方法，用于檢測該主成分中的已知和未知雜質，確保產品質量。
開發(fā)范圍：包括Imp. 1、Imp. 2、Imp. 3、Imp. 4、Imp. 5、Imp. 6等已知雜質以及未知雜質和總雜質。
分析目標概況
方法開發(fā)過程
知識準備和風險分析：
基于對化學結構、色譜知識及ACD/Labs軟件對該產品的有關物質進行分析方法開發(fā)，確保各組分的專屬性、靈敏度及準確性。
PH的確定：利用ACD/Labs軟件預測該主成分及各雜質的log D
各組份在pH 0-11范圍內log D均大于1，無保留的風險，且不受pH影響，考慮到大多數(shù)色譜柱的pH耐用性，pH確定為2.0~8.0范圍。
檢測波長的確定：使用DAD，獲得各組份的DAD數(shù)據，如下圖。
通過DAD圖進行對比，選擇230nm波長作為該分析方法的檢測波長。
分析方法篩選部分：
色譜柱的選擇：由于各組份主要結構差異為苯環(huán)上取代基，本次篩選了Inertsil ODS-3，Welch Xtimate C18, Phenomenex Kinetex-BiPhenyl，最終確定了Phenomenex Kinetex-BiPhenyl 作為本方法中的色譜柱。
流動相的選擇：弱洗脫，本方法中pH的選擇范圍在2.0-8.0，經過篩選，選擇0.1%磷酸溶液為弱洗脫。強洗脫，部分雜質的Log D約為5，經過篩選選擇及乙腈作為流動相，梯度洗脫。
篩選獲得的方法中發(fā)現(xiàn)有一個未知工藝雜質與不同已知雜質有較多的分離問題，是本方法的主要的專屬性方面的風險。
色譜方法優(yōu)化和初步鑒定：
1、使用一臺儀器（A品牌），設計兩個梯度，三個柱溫（25℃、30℃、35℃）的兩因素梯度優(yōu)化實驗
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據以上條件得到的圖譜，使用 AutoChrom 軟件進行建模，模型如下：
從模型分析，隨著柱溫的升高以及更緩（增加一個梯度拐點）的洗脫梯度，未知雜質出峰位置會相對主峰、Imp.2和 Imp.3發(fā)生較大后移。在柱溫40℃及以下洗脫梯度（表一）時，未知雜質出峰在Imp.3后，分離較好（軟件中顯示分離度：4.4），且柱溫耐用性范圍較寬（可達±5℃），故以柱溫40℃和表一梯度作為初步確認的中心點實驗條件，在相同品牌不同設備編號的儀器上進行方法確認實驗。
表一：梯度表（柱溫40℃）
2、使用中心點實驗條件在相同品牌不同設備編號的儀器上進行重現(xiàn)，圖譜如下：
不同設備編號實驗結果表：
解析：儀器2與儀器3實驗結果，Imp.3與未知雜質實際分離度和軟件模擬結果重現(xiàn)度高，而儀器1相對另外兩臺儀器，主峰保留時間提前了近兩分鐘，同時Imp.3與未知雜質分離最差。其原因可能與泵和管路的差異有關。
3、為了確保后續(xù)方法在不同儀器能有較好的重現(xiàn)性，在分離最差的儀器（儀器1）上重新進行梯度溫度雙因素建模，設計洗脫梯度和三個柱溫（25℃、35℃、45℃）進行兩因素實驗以建立數(shù)據模型， 洗脫梯度如下表：
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據以上條件得到的圖譜進行建模，模型如下：
基于儀器1上的建立的新模型，并比較在原方法開發(fā)的儀器上建立的模型，重新調整中心點的位置到柱溫35℃及以下洗脫梯度（表二）。此時未知雜質與Imp.3分離較好（軟件預測分離度：5.2），且柱溫耐用性范圍較寬（可達±5℃），故以柱溫35℃和表二梯度作為中心點實驗條件，在儀器1上進行實驗。
表二：梯度表（柱溫35℃）
4、使用中心點實驗條件在相同品牌不同設備編號的儀器上進行重現(xiàn)
儀器1上中心點實驗加雜溶液（主成分：1mg/ml，各雜質：1μg/ml）圖譜如下：
解析：經過實驗發(fā)現(xiàn)，Imp.3 與未知雜質實際分離度為：5.7，和軟件模擬重現(xiàn)度好，結合原模型獲得的空間，調整中心點，確定使用該梯度條件及柱溫為 35℃。
方法耐用性范圍的確定：
利用AutoChrom 軟件進行耐用性預測，并使用統(tǒng)計學軟件（JMP）對方法參數(shù)的范圍和相互作用進行探索，建立耐用性空間。
下表展示了選取的變化因素及高低水平的設置，在AutoChrom 軟件中預測出如下條件變化產生243個實驗組合的最小分離度。
利用JMP對方法參數(shù)的范圍和相互作用進行探索，將AutoChrom 軟件中模擬出243個實驗的最小分離度導入統(tǒng)計學軟件（JMP），進行處理得到如下結果：
解析：由預測值-實際值圖可以得出，本數(shù)據模型RSq值為0.95，模型準確度較高，故AutoChrom 軟件模擬預測出的243個實驗結果具有參考意義，上表設定的條件范圍為耐用性空間范圍；由預測刻畫器圖可以看出，有機相起始比例、有機相終止比例、柱溫和流速對于分離度有影響，其中柱溫的影響是顯著的，由模型數(shù)據和統(tǒng)計學處理結果可以初步確定本方法在柱溫35℃，流速為1.2ml/min，洗脫梯度為如下表格。
在此數(shù)據模型下，探索統(tǒng)計學軟件（JMP）對于方法開發(fā)階段的幫助，在預測刻畫器中，使用設計空間刻畫器，設置我們所需要達到的低分離度，可以得到我們滿足分離要求的空間，由于本方法模型數(shù)據均符合分離要求，在此設計一個較大的分離度要求（分離度≥2.5）
解析：在設計空間刻畫器中可以看到，模型數(shù)據中滿足分離度要求（分離度≥2.5）的條件占比在97.56%，如需找到一空間使所有分離度均≥2.5，可繼續(xù)內移。
解析：在內移至所有條件均滿足分離度要求（分離度≥2.5）時，此時的方法為耐用性范圍為：有機相起始比例（28±1%）、有機相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時間（25±1min）、柱溫（30~37℃）及流速（1.2±0.1ml/min）；在此基礎上將限值發(fā)送到模擬器對耐用性范圍進行驗證。
解析：由模擬器模擬后得到，耐用性范圍與設計空間刻畫器一致。
從實際出發(fā)，以實驗為基礎來論證本方法耐用性空間，在對分離影響較大的各個因素中取邊界點，利用統(tǒng)計學軟件進行實驗設計，設計出12針處于耐用性空間邊界的12個色譜條件，如下表格：
并且在儀器1進行實驗，實驗數(shù)據如下：
解析：在耐用性空間邊界點的12個色譜條件下，Imp.3與未知雜質分離均較好，主峰及其他已知雜質與相鄰峰分離也較好。
為了進一步確保此方法在不同品牌儀器間差異，再從統(tǒng)計學軟件設計的12個色譜條件中選擇序號1、2、3、7、9和10色譜條件（每個因素的高低水平都各有三個實驗條件，相當于也是均勻分布在耐用空間上的6個點），在不同品牌儀器進行實驗，圖譜如下：
解析：在不同品牌儀器中，6個色譜條件下，主峰和已知雜質與相鄰峰分離均較好，本方法耐用性空間建立成功。
耐用性范圍為：有機相起始比例（28±1%）、有機相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時間（25±1min）、柱溫（35±5℃）及流速（1.2±0.1ml/min）。
結論
本研究成功開發(fā)了一種基于ICH Q14的HPLC分析方法，用于某主成分及其雜質的檢測。利用ACD/ AutoChrom 軟件和統(tǒng)計學工具，優(yōu)化了色譜條件，確保了方法的專屬性、準確度和靈敏度，并建立了方法的耐用性空間。
Kinetex Biphenyl
• 出色的分離能力
• 耐用且可靠
• 100 % 水溶液穩(wěn)定
具備 C18 無法提供的選擇性！
不僅僅只是高性能和強保留，Kinetex Biphenyl 還擁有傳統(tǒng) C18 色譜柱無法媲美的能力。可提供具有固定相的核-殼顆粒所帶來的高性能，這種固定相能夠為反相方法開發(fā)中改善選擇性的優(yōu)選。使用 Kinetex Biphenyl 色譜柱可增強保留能力，獲取更高的靈敏度和整體結果；尤為適合芳香族化合物的分析。
芳香族 π-π 相互作用
在聯(lián)苯基的芳環(huán)和目標分子的芳環(huán)以及 π 電子之間
疏水性相互作用
發(fā)生在 Biphenyl 配體的碳骨架與目標分析物之間
弱離子或偶極-偶極相互作用
雙環(huán)結構產生的高電子密度能夠發(fā)揮類似于弱陽離子交換劑的作用，從而增強堿性分析物的保留能力。
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