在進(jìn)行掃描電鏡觀察前，要對(duì)樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是:盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好，沒(méi)有變形和污染，樣品干燥并且有良好導(dǎo)電性能。
一、樣品的初步處理
1、取材
掃描電鏡來(lái)說(shuō)，樣品可以稍大些，面積可達(dá)8mm×8mm，厚度可達(dá)5mm。對(duì)于掃描電鏡易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組織表面。
2、樣品的清洗
用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面。由于樣品取自活體組織，其表面常有血液、組織液或粘液附著，這會(huì)遮蓋樣品的表面結(jié)構(gòu)，影響觀察。因此，在樣品固定之前，要將這些附著物清洗干凈。
3、固定
固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同，常用戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大，固定時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。也可用快速冷凍固定。
4、脫水
樣品經(jīng)漂洗后用逐級(jí)增高濃度的酒精或丙酮脫水，然后進(jìn)入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。
二、樣品的干燥
掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進(jìn)行。無(wú)論是水或脫水溶液，在高真空中都會(huì)產(chǎn)生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會(huì)破壞樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進(jìn)行干燥。干燥的方法有以下幾種:
1、空氣干燥法
空氣干燥法又稱(chēng)自然干燥法，就是將經(jīng)過(guò)脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行和節(jié)省時(shí)間;它的主要缺點(diǎn)是在干燥過(guò)程中，組織會(huì)由于脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，該方法一般只適用于表面較為堅(jiān)硬的樣品。
2、臨界點(diǎn)干燥法
臨界點(diǎn)干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時(shí)，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體*汽化，并以氣體方式排掉，來(lái)達(dá)到*干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便，所用的時(shí)間也不算長(zhǎng)，一般約2~3小時(shí)即可完成，所以是常用的干燥方法。
3、冷凍干燥法
冷凍干燥法是將經(jīng)過(guò)冷凍的樣品置于高真空中，通過(guò)升華除去樣品中的水分或脫水劑的過(guò)程。冷凍干燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華，即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過(guò)中間的液態(tài)，不存在氣相和液相之間的表面張力對(duì)樣品的作用，從而減輕在干燥過(guò)程中對(duì)樣品的損傷。
三、樣品的導(dǎo)電處理
生物樣品經(jīng)過(guò)脫水、干燥處理后，其表面不帶電，導(dǎo)電性能也差。用掃描電鏡觀察時(shí)，當(dāng)入射電子束打到樣品上，會(huì)在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累，形成充電和放電效應(yīng)，影響對(duì)圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進(jìn)行導(dǎo)電處理，使樣品表面導(dǎo)電。常用的導(dǎo)電方法有以下幾種:
1、金屬鍍膜法
金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后，不僅可以防止充電、放電效應(yīng)，還可以減少電子束對(duì)樣品的損傷作用，增加二次電子的產(chǎn)生率，獲得良好的圖象。
2、組織導(dǎo)電法
用金屬鍍膜法使樣品表面導(dǎo)電，需要特殊的設(shè)備，操作比較復(fù)雜，同時(shí)對(duì)樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人采用組織導(dǎo)電法(又稱(chēng)導(dǎo)電染色法)，即利用某些金屬 溶液對(duì)生物樣品中的蛋白質(zhì)?脂類(lèi)和醣類(lèi)等成分的結(jié)合作用，使樣品表面離子化或產(chǎn)生導(dǎo)電性能好的金屬鹽類(lèi)化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導(dǎo)電率。
