干貨錦囊 | 凍干COVID-19診斷試劑盒的配方與工藝開(kāi)發(fā)

冷凍干燥是一種相對(duì)溫和的干燥過(guò)程，但是相比于一般藥品，診斷試劑盒的凍干涉及到一些敏感的生物大分子，因而存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

基于ELISA和PCR方法的疾病診斷試劑盒中使用的試劑往往包含不穩(wěn)定的成分，例如需要使用冷鏈運(yùn)輸?shù)拿负涂贵w，因此，診斷試劑盒的穩(wěn)定商用一直是個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。

生物分子診斷試劑的凍干

不同的分子對(duì)加工和儲(chǔ)存條件表現(xiàn)出不同的敏感性，對(duì)生物大分子而言，不僅需要保證分子在冷凍干燥后的化學(xué)完整性，而且還必須保持其三維結(jié)構(gòu)，來(lái)盡可能大程度地減少由于聚集和變性等因素導(dǎo)致的活性下降。

小劑量診斷試劑

診斷試劑盒通常使用少量可以快速汽化的溶劑。盡管八連管中的幾微升的蒸發(fā)量較少，但仍可以通過(guò)平板或微流體通道來(lái)加速蒸發(fā)?？紤]到Corona Virus Disease 2019病毒肺炎疫情的緊迫性，檢測(cè)試劑盒的產(chǎn)量和生產(chǎn)速度至關(guān)重要，因此許多Corona Virus Disease 2019病毒肺炎診斷試劑盒都采用96孔板，芯片或微流體芯片來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。凍干機(jī)可以在很大程度上緩解這一困境。

生物分子的穩(wěn)定性

盡管大多數(shù)生物分子（例如抗體和酶）對(duì)冷凍干燥的條件不敏感，但仍有些特例存在。對(duì)低溫敏感的蛋白質(zhì)可能會(huì)在凍干過(guò)程中發(fā)生聚集或沉淀，但是這種情況可以通過(guò)緩慢降溫或添加表面活性劑來(lái)緩解。凍結(jié)濃縮效應(yīng)可能會(huì)破壞某些成分，這一效應(yīng)會(huì)隨著pH值一同變化。磷酸鹽緩沖液可能是造成這一效應(yīng)的主要原因，更換pH緩沖液或快速冷卻通常可以解決此問(wèn)題。蛋白質(zhì)也容易受到界面效應(yīng)的影響，這一效應(yīng)與冰晶表面積成比例。通?？梢酝ㄟ^(guò)緩慢冷卻或使用控制成核技術(shù)來(lái)增加晶體的尺寸并減小表面積來(lái)抵消這一效應(yīng)的影響。脫水應(yīng)力會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在某些情況下，需要結(jié)合水才可以保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。加入冷凍保護(hù)劑或凍干保護(hù)劑可以減輕這種情況，并通過(guò)固定蛋白質(zhì)和/或模仿結(jié)構(gòu)水的作用來(lái)避免脫水應(yīng)力。

甘油效應(yīng)

PCR試劑中甘油的存在（如圖1）會(huì)造成嚴(yán)重的后果，因?yàn)樗诔Ｒ?guī)的冷凍過(guò)程中不會(huì)凝固。如果溶液儲(chǔ)備充足的情況下，可以通過(guò)加入溶液稀釋甘油或添加賦形劑的方法來(lái)解決。但是，干餅（dried cake）中仍可能存在甘油，這會(huì)極大的影響穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)。Corona Virus Disease 2019病毒肺炎診斷試劑盒對(duì)于保質(zhì)期的要求可能不如其他診斷試劑盒高，只需要幾個(gè)月的保質(zhì)期即可，因此也可以使用低溫保存。這樣的話，甘油的存在對(duì)活性成分的穩(wěn)定性影響較小。

 
                                                                 圖1. PCR試劑中甘油的存在

容器和封裝

凍干容器（例如小瓶、試管、孔板、芯片等）和封裝的方式對(duì)熱傳遞和熱穩(wěn)定性具有重大的影響。除了密封過(guò)程中實(shí)現(xiàn)*無(wú)水的挑戰(zhàn)之外，有些孔板對(duì)水的滲透性甚至大于封口（如圖2）。Ward博士在Webinar中提到，在低氧氣和低濕度條件下采用受控環(huán)境，并使用柔性隔離器可以降低產(chǎn)品中的水分含量。對(duì)于Corona Virus Disease 2019病毒肺炎檢測(cè)而言，初始性能和快速生產(chǎn)可能比長(zhǎng)期穩(wěn)定性更重要，因此某些密封措施可能不是必要的。

                       圖2 封蓋相關(guān)過(guò)程圖示

冷凍干燥設(shè)備

由于大多數(shù)相關(guān)企業(yè)都在提高Corona Virus Disease 2019病毒肺炎檢測(cè)試劑盒的產(chǎn)量，而非其長(zhǎng)期穩(wěn)定性。因此中試型凍干機(jī)即可滿足Corona Virus Disease 2019病毒肺炎檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)需求。一個(gè)典型的代表，SP Scientific生產(chǎn)的中試凍干機(jī)Ultra，可以一批凍干多達(dá)5,000個(gè)2 mL的西林瓶。對(duì)于大多數(shù)檢測(cè)試劑的生產(chǎn)而言，這樣的產(chǎn)量足以滿足需求。其他更大型的專為制藥行業(yè)設(shè)計(jì)的生產(chǎn)型凍干機(jī)，還具有診斷試劑生產(chǎn)所需的其他功能，例如蒸汽滅菌等。

SP Scientific Ultra 中試和小批量冷凍干燥機(jī)

SP Ultra中試型凍干機(jī)具有較大的產(chǎn)品擱板面積和容積率，可以輕松處理每批次多達(dá)5,000個(gè)2mL西林瓶或144個(gè)96孔板。

SP Scientific Benchmark生產(chǎn)型凍干機(jī)

SP Benchmark生產(chǎn)型凍干機(jī)專為更大批量的診斷試劑產(chǎn)品的生產(chǎn)而設(shè)計(jì)。其擁有一個(gè)典型的圓形產(chǎn)品室和內(nèi)部的冷凝器設(shè)計(jì)，可改善低塌陷溫度的診斷試劑產(chǎn)品在極低的層板溫度下干燥時(shí)蒸氣輸送。層板面積從2㎡到20㎡不等。

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總結(jié)

以上所討論的問(wèn)題中，重要的是需要根據(jù)所討論分子的敏感性的不同，采用合適的凍干策略。同時(shí)還要考慮到其他對(duì)于診斷試劑的凍干要求。在進(jìn)行Corona Virus Disease 2019病毒肺炎檢測(cè)試劑的凍干中，試劑的體積通常較小，但批次數(shù)量較大，并且優(yōu)先重點(diǎn)是產(chǎn)量而不是長(zhǎng)期穩(wěn)定性。因此，在設(shè)計(jì)專門用于Corona Virus Disease 2019病毒肺炎檢測(cè)試劑盒的凍干方案時(shí)需要考慮這一點(diǎn)。