工藝詳解 | 關(guān)于PCR診斷試劑的凍干思考

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是分子生物學(xué)中廣泛使用的一種方法，用于制作特定DNA片段的多個(gè)拷貝。PCR能夠使特定目標(biāo)/測(cè)試樣本的少量（低至單個(gè)拷貝）DNA以指數(shù)方式擴(kuò)增，以生成數(shù)千到數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝的特定DNA片段。如果目標(biāo)樣品是RNA，也可以添加前體逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程 (RT-PCR)。RT過(guò)程首先將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，然后通過(guò)PCR過(guò)程對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

以下是經(jīng)典PCR方法中涉及的典型試劑和組分以及它們各自所起的作用：

1、核苷酸（例如：三磷酸核苷，dNTP）——是用于制造新DNA的分子構(gòu)件，即“原材料"；

2、酶

I. (Taq) DNA聚合酶——驅(qū)動(dòng)DNA復(fù)制過(guò)程所需的酶；

II.逆轉(zhuǎn)錄酶——將目標(biāo)RNA轉(zhuǎn)化為DNA所需的酶；

3、引物——合成DNA寡核苷酸所需的短的單鏈DNA/RNA片段，有專門(mén)設(shè)計(jì)以適配目標(biāo) DNA區(qū)域的側(cè)翼。它們?yōu)?/span>DNA合成提供了起點(diǎn)。一般需要兩個(gè)引物，分別用于目標(biāo)區(qū)域的兩側(cè)；

4、檢測(cè)探針或染料

I. 探針——熒光標(biāo)記的寡核苷酸

結(jié)合每個(gè)引物的下游區(qū)域。一般需要兩種不同的探針，當(dāng)它們都連接到特定的DNA片段時(shí)則會(huì)發(fā)出熒光，以在擴(kuò)增過(guò)程中提供可檢測(cè)的指示信號(hào)；

II. 染料——在DNA存在時(shí)會(huì)發(fā)出熒光，以在擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)提供可檢測(cè)的指示信號(hào)；

5、其他賦形劑，如MgCl2輔因子、pH緩沖液、甘露醇、海藻糖、BSA、PEG2000等；

6、目標(biāo)DNA/RNA

I. 對(duì)于診斷試劑盒，指的是試劑盒正在檢測(cè)并準(zhǔn)備復(fù)制的目標(biāo)DNA（來(lái)自病毒、細(xì)菌等）；或者從被測(cè)樣品中進(jìn)行提取（如果可行的話）；

II. 用于研究/實(shí)驗(yàn)室工作——要復(fù)制的特定DNA。

PCR方法存在的處理挑戰(zhàn)

PCR 方法存在許多處理挑戰(zhàn)。各個(gè)組分需要在96孔板或“雞尾酒"離心管中進(jìn)行準(zhǔn)確組合。這些組分都需要冷藏，并且保質(zhì)期也相對(duì)較短，同時(shí)交叉污染會(huì)是一個(gè)大問(wèn)題。更糟糕的是，工作臺(tái)移液錯(cuò)誤也會(huì)造成麻煩。

標(biāo)準(zhǔn)PCR過(guò)程需要特定的熱循環(huán)重復(fù)加熱/冷卻反應(yīng)試管30-40個(gè)循環(huán)，以實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增過(guò)程。擴(kuò)增儀也應(yīng)該有一個(gè)熒光計(jì)來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增的目標(biāo)DNA。

另外還有一些更新的擴(kuò)增方法，例如環(huán)介導(dǎo) (LAMP) 和重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA) ，這些方法是等溫過(guò)程，不需要熱循環(huán)和使用特殊設(shè)備。

                          圖1：PCR擴(kuò)增熱循環(huán)儀

最新的技術(shù)則是將試劑加載到微流體通道/芯片上。以更少量的試劑和更低熱量有望實(shí)現(xiàn)更快和更精確的溫度循環(huán)，從而產(chǎn)生更快的結(jié)果。

                                           圖2：微流控PCR芯片

PCR&冷凍干燥

冷凍干燥已成為PCR過(guò)程的一個(gè)重要流程，主要用于單個(gè)試劑和最終產(chǎn)品檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)。研究表明，PCR 擴(kuò)增效率通常不會(huì)由于單個(gè)試劑或PCR診斷試劑盒使用了凍干而受影響。雖然凍干可能會(huì)使探針的熒光強(qiáng)度略有下降，但并不影響整個(gè)測(cè)量過(guò)程。

凍干PCR產(chǎn)品追求1-3%的最終水分含量。建議通過(guò) Karl-Fisher 滴定法測(cè)量水分。

凍干PCR 試劑和診斷試劑盒具有很強(qiáng)的吸濕性。從凍干機(jī)中取出產(chǎn)品時(shí)，必須小心避免暴露在環(huán)境濕氣中。濕度受控的房間或隔離設(shè)備可用于減緩水分的再吸收。對(duì)于產(chǎn)品的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，試劑必須密封在防潮容器中，例如鋁袋。

冷凍的聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶可能含有高達(dá)50%的甘油作為冷凍保護(hù)劑和穩(wěn)定劑。甘油不利于凍干，因?yàn)樗鼤?huì)干擾水分的去除，從而影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)。因此凍干時(shí)要注意優(yōu)先選擇不含甘油的試劑。

凍干PCR

用于PCR試劑的凍干設(shè)備須知

由于測(cè)量的試劑樣品量以微升為單位，一批次凍干PCR試劑中的總水分含量非常小。冷凍干燥機(jī)設(shè)計(jì)不需要具有1:1的擱板表面與冰冷凝器表面積比，因?yàn)檫@主要用于高水分、散裝液體或西林瓶應(yīng)用。

當(dāng)產(chǎn)品樣本大小在微升范圍內(nèi)時(shí)，是很難使用產(chǎn)品探針的。因此在工藝開(kāi)發(fā)時(shí)，皮拉尼/電容壓力計(jì)壓力差比較法是更為推薦的干燥終點(diǎn)工具。如果凍干機(jī)配備隔離閥且能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)開(kāi)啟和關(guān)閉，也可以使用壓力升法進(jìn)行測(cè)試。

另外，凍干機(jī)中的制冷系統(tǒng)也應(yīng)考慮精準(zhǔn)優(yōu)化（與常識(shí)保留冗余的設(shè)計(jì)理念相反），較小的壓縮機(jī)可以大大減少室內(nèi)熱量的消耗。這意味著對(duì)于電壓和能源占用較小。風(fēng)冷的中試型凍干機(jī)型號(hào)更適用于中等批量的診斷試劑的生產(chǎn)和研發(fā)，這避免了對(duì)冷卻水設(shè)施的需求，因?yàn)槔鋮s水設(shè)施對(duì)于大部分PCR試劑盒生產(chǎn)場(chǎng)地而言中可能并不容易獲取。

SP Scientific VirTis Ultra系列凍干機(jī)非常適合診斷應(yīng)用。它以緊湊的配置提供超過(guò)2平方米的擱板面積。這使得客戶在樣品處理中具有很大的靈活性。

         圖3：SP VirTis Ultra 中試和小型生產(chǎn)凍干機(jī)

PCR診斷檢測(cè)試劑盒的凍干工藝須知

凍干PCR診斷試劑盒的明顯優(yōu)勢(shì)是消除了試劑盒冷藏運(yùn)輸和儲(chǔ)存的冷鏈依賴，延長(zhǎng)了其可用保質(zhì)期。

96孔板是用于PCR診斷試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)配置。相比較手動(dòng)進(jìn)樣這種繁瑣的操作，使用自動(dòng)化液體灌裝設(shè)備，除了更快的裝載時(shí)間和更高的吞吐量外，它還提供更好的過(guò)程控制和可重復(fù)性。

在批量裝載到凍干機(jī)的過(guò)程中，控制產(chǎn)品的蒸發(fā)和產(chǎn)品溫度會(huì)是一個(gè)問(wèn)題，特別是對(duì)于具有較大批量的較大裝置，*裝載需要比較長(zhǎng)的時(shí)間。對(duì)擱板進(jìn)行預(yù)冷上會(huì)降低上述問(wèn)題帶來(lái)的影響。如果加載到芯片或微流體通道上，那么蒸發(fā)和傳熱又會(huì)是一個(gè)大問(wèn)題。

凍干過(guò)程取決于足夠的熱量傳遞到產(chǎn)品中。大多數(shù)96孔是塑料管，底部與冷凍干燥機(jī)擱板接觸的表面積很小。在冷凍干燥過(guò)程中可以使用鋁制冷卻塊來(lái)增加傳導(dǎo)熱傳遞。

                             圖4：用于 96 孔的鋁質(zhì)傳熱模具

對(duì)流傳熱在凍干中也很重要，因?yàn)樗梢詭椭a(chǎn)品在貨架上更均勻地分配熱量，減輕由輻射傳熱差異引起的邊緣效應(yīng)。在產(chǎn)品支持的前提下，使用更低的真空度（例如：100mTorr 而不是 60mTorr）將提供更均勻的對(duì)流傳熱。然而，許多PCR試劑的塌陷溫度非常低，因此凍干過(guò)程中設(shè)置較高的壓力可能并不總是可行的?？梢栽谂浞街刑砑淤x形劑，提高塌陷溫度，以允許更高的壓力設(shè)置。這樣做的其他好處包括使配方更容易轉(zhuǎn)移到其他可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)非常低真空設(shè)置的凍干機(jī)（減少工藝放大的風(fēng)險(xiǎn)），以及減少阻塞流現(xiàn)象發(fā)生的概率。

出于信號(hào)校準(zhǔn)的目的，診斷試劑盒通常包含不含目標(biāo)DNA/RNA的陰性對(duì)照混合物和含有目標(biāo)DNA/RNA的陽(yáng)性對(duì)照混合物。除了包含測(cè)試樣品的混合物之外，還分析對(duì)照樣品，并比較熒光信號(hào)以確定患者樣品是陽(yáng)性還是陰性。處理陽(yáng)性對(duì)照樣品的一個(gè)問(wèn)題是凍干機(jī)內(nèi)部存在交叉污染的高風(fēng)險(xiǎn)。因此建議客戶分別使用多個(gè)凍干機(jī)，陽(yáng)性對(duì)照始終在同一設(shè)備中進(jìn)行處理。

單個(gè)PCR試劑源材料的冷凍干燥

除了延長(zhǎng)保質(zhì)期和避免對(duì)供應(yīng)冷鏈的需求外，實(shí)驗(yàn)室使用凍干PCR試劑的其他好處包括：

●   更穩(wěn)健的工藝，更高的可靠性和更少的批次變化，因?yàn)槔鋬龈稍锎蟠蠼档土藢?shí)驗(yàn)室工作臺(tái)移液錯(cuò)誤和污染的可能性；

●   避免多次凍融循環(huán)的破壞性影響；

●   減少設(shè)置和處理時(shí)間；

●   減少過(guò)期產(chǎn)品的浪費(fèi)，降低運(yùn)輸和儲(chǔ)存成本。

為方便起見(jiàn)，預(yù)配制的凍干PCR“Master-Mix"試劑目前也可在市面上進(jìn)行購(gòu)買(mǎi)，它可以通過(guò)消除實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)上的一些混合步驟來(lái)提高通量。主混合物通常包含核苷酸、酶、輔因子和緩沖液。

凍干微珠

一些 PCR 試劑供應(yīng)商在實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中采用的一種常見(jiàn)方法是提供冷凍干燥的試劑預(yù)混珠，在凍干之前使用專門(mén)的設(shè)備用液氮冷凍。

                          圖5：凍干 PCR 微珠

在凍干之前使用液氮預(yù)凍試劑存在權(quán)衡取舍。極快的冷凍速度可最大限度地減少冷凍濃度效應(yīng)，例如pH變化。然而，它也會(huì)帶來(lái)非常小的冰晶尺寸，這會(huì)導(dǎo)致在干燥過(guò)程中對(duì)蒸汽流動(dòng)的阻力更大并且干燥時(shí)間更慢。PCR的小樣本量可以降低這方面的影響，但需要凍干機(jī)提供更冷的擱板溫度和更低的真空度來(lái)防止珠子在初級(jí)干燥過(guò)程中熔化。

此外，珠子必須保持冷凍。可以使用冷藏的冷盤(pán)來(lái)輔助。冷凍干燥機(jī)擱板也需要預(yù)冷，以避免產(chǎn)品在抽真空之前熔化。要注意的是在產(chǎn)品室門(mén)在真空下密封之前，預(yù)冷凍擱板會(huì)導(dǎo)致環(huán)境條件下結(jié)霜。

冷凍干燥的顆粒或珠子通常放置在PCR管中，然后密封在防潮袋中。

綜上所述，PCR診斷試劑的凍干需要考慮多種因素，其中包括商用原料的類型和凍干機(jī)的選用。萊奧德創(chuàng)可以為客戶提供一站式診斷試劑凍干工藝解決方案，從配方的設(shè)計(jì)到商業(yè)化生產(chǎn)階段均可為客戶提供快速、可靠的委托服務(wù)。

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