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白細(xì)胞介素-2的研究進展及應(yīng)用

閱讀:1519      發(fā)布時間:2013-6-13
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 隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展,運用重組表達技術(shù)來生產(chǎn)預(yù)防和治療疾病的制品已成為近幾年研究的熱點。白細(xì)胞介素-2是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,它能夠有效地提高免疫功能,醫(yī)學(xué)上已用于預(yù)防和治療一些常規(guī)方法難以治療的疾病,如腫瘤等;在獸醫(yī)方面因其能提高疫苗的免疫效果,尤其是在基因工程亞單位苗的免疫效果而倍受重視,展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。
  一、白細(xì)胞介素-2的受體及其生物學(xué)功能:
  白細(xì)胞介素-2(IL-2)是一種zui早發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子,在1979年第二屆淋巴因子會議上正式命名,它必須和IL-2受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。1981年,Robb等發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞表面存在IL-2受體。IL-2R是由3個糖蛋白亞基組成的,分別為α,β,γ鏈,分子量為55kD,75kD和64kD,故又稱p55,p75和p64。單個亞基不能傳遞IL-2信號,只有2或3個亞基組成復(fù)合體方能發(fā)揮受體功能。依據(jù)與IL-2親和力的大小,可將IL-2R分為3類,中、高親和力受體分別由。αβ和αβγ鏈組成,能傳導(dǎo)IL-2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞溶解信息;低親和力受體由α鏈組成,不能傳導(dǎo)IL-2介導(dǎo)的信息。IL-2Rγ是IL—4、IL—7、IL—15、IL—9等多種細(xì)胞因子受體的功能性組成單位;參與多種免疫學(xué)功能的調(diào)控。雞IL-2也有與哺乳動物IL—2相似的受體。IL—2通過與表達IL—2R的細(xì)胞表面的IL—2R結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性。
  二、IL-2的種屬特異性:
  大量交叉實驗表明,IL—2的種屬特異性是有一定規(guī)律的,一般呈下行性,即進化程度高的動物的IL-2可以作用于進化程度較低的動物。如人和猿的IL-2。幾乎可以作用于所有哺乳動物的,細(xì)胞;但其它哺乳動物的IL-2很少可以作用于人:在進化程度相當(dāng)?shù)膭游镏校诧@示明顯的種屬特異性,哺乳動物IL-2之間有交叉性,如牛IL-2可以作用于水牛和山羊,但活性僅有35%,對IL-2的氨基酸分析表明,這與其受體結(jié)合部位氨基酸序列較保守有關(guān),另外,氨基酸排列順序和形成的空間構(gòu)型也有很大關(guān)系。
  人和其它哺乳動物的IL-2不作用于家禽,原因是禽與哺乳動物種間隔離較大。在IL-2體外誘生實驗中;禽與哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)條件不同,細(xì)胞密度、培養(yǎng)時間、溫度、絲裂原的量都有不同。禽脾細(xì)胞加ConA和2%同種雞血清誘導(dǎo)20h后,分泌類似人IL-2的因子,能使ConA活性的雞T—cell生長,未活化的不能生長。雞CM(條件培養(yǎng)基)不支持ConA活化的人、鼠淋巴細(xì)胞,人、鼠CM也不支持雞ConA活化淋巴細(xì)胞。家禽細(xì)胞因子與人和哺乳動物的同源性極低,如雞IFN基因與哺乳動物I型IFN核苷酸同源性zui高只有43%,氨基酸同源性zui高只有24%。
  三、白細(xì)胞介素-2的cDNA克?。?
  1985年鼠IL-2cDNA,首先克隆成功。建立活化的鼠T細(xì)胞系cDNA文庫。建庫所用載體含有SV40早期啟動子,轉(zhuǎn)染COS—7細(xì)胞后,使插入片段表達,表達后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-2活性,篩選出3個具有IL-2活性的cDNA克隆。
  人IL—2(hIL—2)克隆成功于1986年。用ConA誘導(dǎo)人的白血病T細(xì)胞系Jurkat—111分泌IL—2,然后提取mRNA注入蛙卵進行體外翻譯,建立cDNA文庫,再將重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,用mRNA與之雜交,回收吸附于膜上的mRNA,再進行體外翻譯,從而克隆了*個hIL-2cDNA。
  同年,牛IL-2(bIL-2)cDNA克隆成功;建立活化牛淋巴細(xì)胞cDNA文庫后,用hIL—2cDNA探針進行篩選。成熟IL—2含有135個氨基酸,分子量為15.42kD,與人和鼠的IL-2各有65%及50%的同源性。
  李祥瑞于1995年用真核表達系統(tǒng)成功克隆了雞IL-2;并獲得高活性重組雞IL-2。采用SPF雞脾臟T細(xì)胞,體外誘生IL-2,經(jīng)生物學(xué)活性檢測確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中具有IL-2的生物學(xué)活性,提取誘導(dǎo)過的脾單核細(xì)胞的總mRAN,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將核酸片段與質(zhì)粒載體連接,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌DH10B,建立cDNA文庫。所用質(zhì)粒載體為穿梭質(zhì)粒pSV·SPORTI,它既能在大腸桿菌內(nèi)增殖,又帶有SV40,復(fù)制原點及早期啟動子,能在COS-7細(xì)胞中瞬時表達,表達產(chǎn)物經(jīng)生物學(xué)活性檢測,證明其有IL-2活性,經(jīng)過兩輪篩選,共獲得14個陽性克隆。經(jīng)序列分析表明,雞IL-2與人和其它哺乳動物IL-2cDNA同源性在50%左右。
  四、雞IL-2的純化及生化特性:
  Shnetzler等首先將由外周血淋巴細(xì)胞誘生的IL-2用40%-80%硫酸銨沉淀后,用SephadexG-100凝膠層析,IL-2活性峰以PBS透析,以Blue-sepharose膠層析后進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果2個活性峰分子量分別為9.0-11.5kD和19.5-21.5kD,后者可能是前者的雙聚體。Vainio等用此方法得到分子量為13kD的分子,用等電聚焦估計雞IL-2的PI為5.9。
  Fredericksen和Sharma將由脾淋巴細(xì)胞誘生的IL-2超濾濃縮,濃縮物通過Phenyl-sepharose柱,未吸附蛋白進一步用陰離子交換劑柱層析,再以Superose-12柱進行層析。結(jié)果得到2個活性峰,分子量分別為26.0kD和14.0kD,經(jīng)SDS-PAGE電泳*峰形成分子量的30.0kD的帶,第二峰可能因蛋白含量太低而無帶形成。同時發(fā)現(xiàn)雞IL-2親水性低,與鼠IL-2的高親水性不同,可用Phenyl-sepharose柱純化。
  Myers等報道了利用5步法純化雞IL-2的結(jié)果:(1)超濾縮,(2)硫酸銨沉淀,(3)SephadroseG—100凝膠過濾層析;(4)反相高壓液相層析,(5)Phenyl—sepharose層析。SephfidexG-100層析后得到2個活性峰,SDS—PAGE電泳后分子量分別為17.5—25.0kD和36.0-39.0kD。高分子量峰經(jīng)解聚烷基化后再以SephasexG—100層析,得到一分子量為17.5kD的峰,說明雞IL—2可以形成聚合體或與其他蛋白質(zhì)聚合。
  五、IL-2的應(yīng)用:
  1.作為免疫治療劑。Weinberg報道,多次使用IL—2可以明顯降低實驗性感染豚鼠生殖系統(tǒng)單純皰疹病毒感染的復(fù)發(fā)率;lz等報道,使用雞ConA活化T細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子,可以使雞腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)器官侵入率降低51%-60%;此種細(xì)胞因子注入雞胚,同樣可以降低孵化期雞胚的沙門氏菌器官侵入率。Quiroga等報道,將重組牛IL—2注入牛乳房,可以明顯降低細(xì)菌性乳房炎的發(fā)病率。
  2.構(gòu)建新型基因工程苗。Ramshaw等、Flexner等先后報道將小鼠或人IL—2cDNA與含禽流感血凝素(HA)基因的痘病毒重組,獲得表達IL-2的重組病毒。將這種重組病毒與不含IL—2基因的痘病毒同時接種裸鼠;結(jié)果顯示,IL—2的插入并不影響HA的表達水平及免疫原性,但可以防治對裸鼠的致死。說明插入細(xì)胞因子可以大大提高活病毒載體的安全性。Hazama等將IL—2基因與牛單純性皰疹病毒糖蛋白D基因融合,真核細(xì)胞內(nèi)表達融合蛋白;免疫小鼠后攻毒。結(jié)果該融合蛋白可以*保護小鼠免疫病毒攻擊,而以氫氧化鋁為佐劑但不含IL—2的重組糖蛋白只產(chǎn)生部分保護,IL—2在體內(nèi)的半衰期也因此延長大約4倍。表明采用此種方式獲得IL—2抗原重組蛋白,是研制新一代基因工程苗的另一途徑。
  3.作為免疫增強劑。目前亞單位苗是疫苗研究的熱點,但亞單位苗只能對寄生蟲產(chǎn)生部分保護力,許多獸醫(yī)工作者把注意力集中到亞單位苗所需的免疫增強劑(Immunopotentiator)上。重組細(xì)胞因子能明顯提高細(xì)菌、病毒和寄生蟲疫苗的免疫效果。細(xì)胞因子免疫增強劑不同于以往的化學(xué)佐劑,它們能調(diào)節(jié)動物對疫苗的反應(yīng),包括免疫細(xì)胞向接種部位移動,抗原提呈,促進Th細(xì)胞的產(chǎn)生,B細(xì)胞的成熟和分化,激活包括NK細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和肥大細(xì)胞在內(nèi)的非特異性殺傷細(xì)胞。重組人IL—2能提高傷寒桿菌活苗和莢膜多糖亞單位苗的免疫效果,重組牛IL—2與牛皰疹病毒I型活苗一起使用;血清中牛和抗體滴度比單獨使用疫苗組提高6倍。用牛皰疹病毒糖蛋白亞單位苗免疫牛,并注射IL—2,可顯著提高特異性抗體滴度,特異性細(xì)胞毒反應(yīng)和特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。重組牛IL-1、IL—2能促進牛病毒性腹瀉死苗的免疫效果。IL—2分別于狂犬病疫苗或瘧疾疫苗聯(lián)合使用,對相應(yīng)抗原的攻擊有保護作用。

——摘編自李宏梅、李祥瑞、郭慧君的文章
 

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