為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 讓我們先來(lái)看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過(guò)的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說(shuō)起來(lái)不可思議，加了葡萄糖后zui大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca²⁺和Mg²⁺等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)閦ui終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。

有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是* 的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：*，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩，后面我再詳細(xì)說(shuō)明。

每個(gè)人都知道，溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。zui容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更*。大家知道SDS專門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然zui后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無(wú)法快速?gòu)?fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。

不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時(shí)間一長(zhǎng)就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個(gè)全面的介紹。酚（Phenol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來(lái)zui大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來(lái)。這時(shí)候如果放到－20℃，時(shí)間一長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點(diǎn)不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過(guò)分小心了。高濃度的鹽會(huì)水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺(jué)發(fā)生了鹽的沉淀，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的RNA會(huì)干擾電泳結(jié)果的.

瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬(wàn)不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來(lái)線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。這里暫不深究。

 已經(jīng)提出過(guò)許多方法用于從細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA， 這些方法都含有以下3個(gè)步驟：
細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。
細(xì)菌的收獲和裂解
質(zhì)粒DNA的純化。

（一）細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)
從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中（有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)），然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時(shí)，不必造反性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒DNA。然而，較長(zhǎng)一代的載體（如pBR322）由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)，以便對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時(shí)內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR322－類(lèi)的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來(lái)，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素μg/ml）已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對(duì)于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。

（二）細(xì)菌的收獲和裂解
細(xì)菌的收獲可通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來(lái)選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。
1）大質(zhì)粒（大于15kb）容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類(lèi)去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來(lái)所需要的作用力。
2）可用更劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。
3）一些大腸桿菌菌株（如HB101的一些變種衍生株） 用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類(lèi)，當(dāng)隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類(lèi)會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類(lèi)，而糖類(lèi)可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。
4）當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株（endA+株，如HB101） 中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒?滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育（如用限制酶消化）時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。但如果通過(guò)一個(gè)附加步驟（用酚：氯仿進(jìn)行抽提）可以避免此問(wèn)題。
5）目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來(lái)煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時(shí)從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時(shí)從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。

（三）質(zhì)粒DNA的純化
常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過(guò)嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和（ 每2個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合1個(gè)溴化乙錠分子） 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。本實(shí)驗(yàn)室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒

二、質(zhì)粒DNA的小量制備
細(xì)菌的收獲和裂解 收獲 堿裂解法 煮沸裂解 質(zhì)粒DNA小量制備的問(wèn)題與對(duì)策
質(zhì)粒DNA的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法
（一）細(xì)菌的收獲和裂解
1．收獲
1）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。
2）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。 3）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。

2．堿裂解法
1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris．Cl（pH8.0）
10mmol/LEDTA（pH8.0）
溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2（6.895×104Pa） 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。

2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
1%SDS
蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面 均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
3）加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/Ｌ乙酸鉀
60ml 冰乙酸
11.5ml 水 28.5ml
所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。
蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后 將管置于冰上3－5分鐘。
4）用微量離心機(jī)于4℃12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
5）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 ℃以12000g離心 2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不*酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。
6）用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置2分鐘。
7）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘。
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。
9）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。

i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3－5μg。
ii．如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時(shí)。將剩余的DNA貯存于－20℃。
iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：
3．煮沸裂解
1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。
STET
0.1mol/L NaCL
10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）
1mmol/L EDTA（pH8.0）
5% Triton X-100
2）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。
3）將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。
4）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。
5）用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。
6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。
7）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。
9）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心2分鐘。 10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開(kāi)管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)的液體（2－5）分鐘。 11）用50μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。 注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg ²⁺存在下溫育（V中用限制酶時(shí)）質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9）之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。

（二）質(zhì)粒DNA小量制備的問(wèn)題與對(duì)策
裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒(méi)有會(huì)么麻煩。多年來(lái)，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過(guò)程中，只碰到過(guò)兩個(gè)問(wèn)題：
1）有些工作者進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。
2）在十分偶然的情況下，個(gè)別小時(shí)制備物會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。
三、質(zhì)粒DNA的大量制備
在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒
細(xì)菌的收獲和裂解
收獲
堿裂解法

（一）在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒 許多年來(lái)，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對(duì)生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2－5mg質(zhì)粒DNA，而且重復(fù)性也很好。
1）將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)晚期（DNA 600約0.6）。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長(zhǎng)起來(lái)的小量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種。
2）將含相應(yīng)抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預(yù)加溫至37℃）施放入25ml對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分），所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。
3）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類(lèi)在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過(guò)擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒（如pUC質(zhì)粒）可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無(wú)需擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進(jìn)行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡(jiǎn)化質(zhì)粒純化的過(guò)程。所以一般說(shuō)來(lái)，盡管要在生長(zhǎng)中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。 4）于37℃劇烈振搖（300轉(zhuǎn)/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。

（二）細(xì)菌的收獲和裂解
1．收獲
1）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開(kāi)離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。
2）將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）
1mmol/L EDTA（pH8.0）
2）按步驟1）所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。

2，堿裂解法
1）將冼過(guò)的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[ 來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟3] 重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl（pH8.0）
10mmol/L EDTA（pH8.0）
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2（6.895x104Pa）高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。
2）加1ml（2ml）新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）]。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效工作。
3）加20ml（40ml）新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
1％SDS
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。
4）加15nl（20ml）用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸鉀
60ml 冰乙酸
11.5ml 水
28.5ml 所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質(zhì)－膜復(fù)合物。
5）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開(kāi)剎車(chē)而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分[步驟4）]。
6）上清過(guò)濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
7）用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會(huì)了生沉淀。
8）小心倒掉上清，敞開(kāi)瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮殆盡。
9）用3ml TE（pH8.0）溶解核酸沉淀。

四、質(zhì)粒DNA的純化
聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒DNA
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA
（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒DNA
1）將核酸溶液所得]轉(zhuǎn)入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于4℃下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。
2）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。
3）小心去掉上清，敞開(kāi)管口，將管倒置以使zui后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開(kāi)管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使zui后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
4）用500μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
5）加500μl含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。
6）吸出上清，用400μl TE（pH8.0）溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。
7）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。
8）吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。
9）吸去上清，敞開(kāi)管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到zui后可見(jiàn)的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0）] 后測(cè)量OD 260，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質(zhì)粒DNA/ml）， 然后將DNA貯于－20℃。
10）純化。