分流/不分流進(jìn)樣——《氣相色譜方法及應(yīng)用》

                             一、進(jìn)樣口結(jié)構(gòu)
分流/不分流進(jìn)樣口是毛細(xì)管GC更常用的進(jìn)樣口，它既可用作分流進(jìn)樣，也可用作不分流進(jìn)樣口圖4-2是典型的分流/不分流進(jìn)樣口示意圖。從結(jié)構(gòu)上看，分流/不分流進(jìn)樣口與填充柱進(jìn)樣有明顯的不同，一是前者有分流氣出口及其控制裝置，二是除了進(jìn)樣口前有一個(gè)控制閥外，在分流氣路上還有一個(gè)柱前壓調(diào)節(jié)閥，二是二者使用的襯管結(jié)構(gòu)不同。而分流進(jìn)樣和不分流進(jìn)樣在操作參數(shù)的設(shè)置，對樣品的要求以及襯管結(jié)構(gòu)方面也有很大區(qū)別，下面分別討論之。

 二、分流進(jìn)樣
(一)載氣流路和襯管選擇
分流進(jìn)樣時(shí)載氣流路如圖4-2a所示。進(jìn)入進(jìn)樣口的載氣總流量由一個(gè)總流量閥控制，而后載氣分成兩部分:一是隔墊吹掃氣(1～3mL/min)，二是進(jìn)入汽化室的載氣。進(jìn)入汽化室的載氣與樣品氣體混合后又分為兩部分：大部分經(jīng)分流出口放空，小部分進(jìn)樣色譜柱。以總流量為104 m1/min為例，如果隔墊吹掃氣流設(shè)置為3m1/min，則另101mL/min進(jìn)入汽化室。當(dāng)分流流量為100mL/min時(shí)。柱內(nèi)流量為lml/min，這時(shí)分流比為100:1。注意。此儀器設(shè)計(jì)將柱前壓調(diào)節(jié)閥置于分流氣路上，這就可在總流量不變的情況下，改變柱前壓。柱前壓越高，柱流速越大，分析速度越快。而要在柱前壓(柱流速不變)的條件下改變分流比，則必須調(diào)節(jié)總流更?？偭髁吭酱?，分流比越大。
分流進(jìn)樣口可采用多種襯管，用于分流進(jìn)樣的襯管大都不是直通的，管內(nèi)有縮徑處或者燒結(jié)板，或者有玻瑞珠，或者填充有玻璃毛。這主要是為了增大.與樣品接觸的比表面，保證樣品*汽化.減小分流歧視〔見下面關(guān)于分流歧視問題的討論)。同時(shí)也是為了防止固體顆粒和不揮發(fā)的樣品組分進(jìn)入色譜柱。注意，填充物應(yīng)位于襯管的中間，即溫度更高的地方，也是注射器針尖所到達(dá)的地方，這樣對提高汽化效率，減少注射器針尖對樣品的歧視更為有效。另外，玻璃毛活性較大，不適合于分析極性化合物。此時(shí)可用經(jīng)硅烷化處理的石英玻璃毛。

襯管的上端常用“O”形硅橡膠環(huán)密封。用一段時(shí)間后該環(huán)會老化而造成漏氣。故要及時(shí)更換。當(dāng)進(jìn)樣口溫度超過400℃時(shí)，更好采用石墨密封環(huán)。

(二)樣品的適用性
分流進(jìn)樣適合于大部分可揮發(fā)樣品，包括液體和氣體樣品，特別是對一些化學(xué)試劑(如將劑)的分折。因?yàn)槠渲幸恍┙M分會在主峰前流出。而且樣品不能稀釋、故分流進(jìn)樣住往是理想的選擇。此外，在毛細(xì)管GC的方法開發(fā)過程中，如果對樣品的組成不很清楚。也應(yīng)首先采用分流進(jìn)樣口對于一些相對“臟”的樣品，更應(yīng)采用分流進(jìn)樣，因?yàn)榉至鬟M(jìn)樣時(shí)大部分樣品被放空，只有一小部分樣品進(jìn)入色譜柱，這在很大程度上防止了柱污染。只是在分流進(jìn)樣不能滿足分析要求時(shí)（靈敏度太低），才考慮其他進(jìn)樣方式，如不分流進(jìn)樣和柱上進(jìn)_樣等。 
總之，分流進(jìn)樣的適用范圍寬，靈話性很大。分流比可調(diào)范圍廣，故成為毛細(xì)管GC的*進(jìn)樣方式。
(三)操作參數(shù)設(shè)置
1.溫度
進(jìn)樣口溫度應(yīng)接近于或等于樣品中更重組分沸的點(diǎn)，以保證樣品快速汽化，減小初始譜帶寬度。但溢度太高有使樣品組分分解的可能性。對于個(gè)未知的新樣品。可將進(jìn)樣口溫度設(shè)置為300度進(jìn)行試驗(yàn)。 
2.載氣流速
常用毛細(xì)管GC所用柱內(nèi)載氣線流速為：氦氣30～50cm/s，氮?dú)?/span>20～40cm/s，氫氣40～60cm/s。實(shí)際流速可通過測定死時(shí)間來計(jì)算，通過調(diào)節(jié)柱前從來控制。對于分流進(jìn)樣，還要測定隔墊吹掃氣流量和分流流量，前者一般為2～3mL/min，后者則要依據(jù)樣品情況(如待側(cè)組分濃度等)、進(jìn)樣量大小和分析要求來改變。常用分流比范圍為20:1～200:1，樣品濃度大或進(jìn)樣量大時(shí)，分流比可相應(yīng)增大，反之則減小。用大口徑柱時(shí)分流比小一些(或采用不分流進(jìn)樣)。用微徑柱作快速GC分析時(shí)，分流比要求很大(如1000:1或更高)。另一方面，分流比小時(shí)，分流歧視(見下面關(guān)于分流歧視問題的討論)效應(yīng)可能小一些，但初始譜帶(主要是溶劑譜帶)寬度要大一些。必要時(shí)可采用聚焦技術(shù)。而分流比大時(shí)，初始譜帶寬度小，但分流歧視效應(yīng)可能會增大。所以，在實(shí)際工作中應(yīng)據(jù)樣品情況和分析要求選擇一個(gè)合適的折衷點(diǎn)。
3.進(jìn)樣量和進(jìn)樣速度
分流進(jìn)樣的進(jìn)樣量一般不超過2μL,更好控制在0.5μL以下，因?yàn)橐r管的容積有限，液體汽化時(shí)體積要膨脹數(shù)百倍(見表4-1)。當(dāng)然。進(jìn)樣量還和分流比是相關(guān)的，分流比大時(shí)，進(jìn)樣量可大一些。至于進(jìn)樣速度應(yīng)當(dāng)越快越好，一是防止不均勻汽化，二是保持窄的初始譜帶寬度。因此，快速自動(dòng)進(jìn)樣往往比手動(dòng)進(jìn)樣的效果好。

(四)分流歧視問題
所謂分流歧視是指在一定分流比條件下，不同樣品組分的實(shí)際分流比是不同的，這就會造成進(jìn)入色譜柱的樣品組成不同于原來的樣品組成，從而影響定是分析的準(zhǔn)確度。因此，采用分流進(jìn)樣時(shí)必須注意這個(gè)問題。那么，是什么因素造成分流歧視的呢？

不均勻汽化是分流歧視的上要原因之一，即由于樣品中各組分的極性不同，沸點(diǎn)各異，因而汽化速度各不相同。理論上講，只要汽化溫度足夠高，就能使樣品的全部組分迅速汽化。只要汽化室內(nèi)樣品處于均相氣體狀態(tài)，分流歧視就是可以忽略的。然而，實(shí)際上樣品在汽化室是處于一種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，即必須隨載氣流動(dòng)。從汽化室汽化到進(jìn)入色譜柱的時(shí)間很短(以秒計(jì))，沸點(diǎn)不同的組分到達(dá)分流點(diǎn)時(shí)，汽化狀態(tài)可能不*相同。這樣，由于分流流量遠(yuǎn)大于柱內(nèi)流量，汽化不太*的組分就比*汽化的組分可能多分流掉一些樣品。造成分流歧視的另外一個(gè)原因是不同樣品組分在載氣中的擴(kuò)散速度不同。而擴(kuò)散速度與溫度是成正比的。所以。盡量使樣品快速汽化是消除分流歧視的重要措施，包括采用較高的汽化溫度，也包括使用合適的襯管。 
分流比的大小也會影響分流歧視口一般地講，分流比越大，越有可能造成分流歧視口所以，在樣品濃度和柱容量允許的條件下，分流比小一些有利。至于分流比的測定定是很簡單的，只要在分流出口用皂膜流量計(jì)測定分流流量，再測定柱內(nèi)流量(因?yàn)橹鶅?nèi)流量很小，用皂膜流量計(jì)測定時(shí)誤差較大，故常用測定死時(shí)間的辦法進(jìn)行流量計(jì)算)。二者之比即為分流比。嚴(yán)格地講，兩個(gè)流量值應(yīng)校正到相同的溫度和壓力條件下，才能獲得準(zhǔn)確的分流比。實(shí)際工作中人們更關(guān)心的是分流比的重現(xiàn)性，分流比則常用整數(shù)之比表示，故一般不需要很準(zhǔn)確地測定。
具體分析中要消除分流歧視，還應(yīng)注意色譜柱的初始溫度盡可能高一些。這樣，汽化溫度和柱箱溫度之差就會小一些，因而樣品在汽化室經(jīng)歷的溫度梯度就會小一些，可避免汽化后的樣品發(fā)生部分冷凝。更后一個(gè)問題是色譜柱的安裝，一是要保證柱入口端超過了分流點(diǎn)。二是保證柱入口端處于汽化室襯管的*，即汽化室內(nèi)色譜柱與襯管是同軸的(參看上一章有關(guān)色譜柱安裝的內(nèi)容)。
盡管分流進(jìn)樣有歧視間題，但它仍然是毛細(xì)管GC中更常用的進(jìn)樣方式。在實(shí)際工作中。分流歧視是很難*消除的，但只要操作是重現(xiàn)的，一定程度的歧視是重現(xiàn)的。就可以通過標(biāo)準(zhǔn)樣品的校準(zhǔn)來消除歧視效應(yīng)對定量精度的影響
另一方面。由于分流進(jìn)樣給檢測靈敏度提出了更高的要求，而當(dāng)樣品濃度太低時(shí)。分流進(jìn)樣并不總是合適的選擇。除了進(jìn)行樣品預(yù)處理(如濃縮)外。讀者很容易想到不分流進(jìn)樣。既然分流進(jìn)樣是因?yàn)橹萘啃　悠窛舛雀叨坏貌徊捎玫姆椒?。那么低濃度樣品采用不分流進(jìn)樣，以提高檢測靈敏度就是理所當(dāng)然的選擇了。

三、不分流進(jìn)樣
(一) 載氣流路和襯管選擇
不分流進(jìn)樣與分流進(jìn)樣采用同一個(gè)進(jìn)樣口，顧名思義，不分流進(jìn)樣就是將分流氣路的電磁閥關(guān)閉[圖4-2(b)]，讓樣品全部進(jìn)入色潛柱。這樣做的好處是顯而易見的，既可提高分析靈敏度，又能消除分流歧視的影響。然而，在實(shí)際工作中、不分流進(jìn)樣的應(yīng)用遠(yuǎn)沒有分流進(jìn)樣普遍，只是在分流進(jìn)樣不能滿足分析要求時(shí)(主要是靈敏度要求)，才考慮使用不分流進(jìn)樣。這是因?yàn)?/span>不分流進(jìn)樣的操作條件優(yōu)化較為復(fù)雜。對操作技術(shù)的要求高。其中一個(gè)更突出的問題是樣品初始譜帶較寬(樣品汽化后的體積相對于柱內(nèi)載氣流量太大)。汽化的樣品中溶劑是大量的，不可能瞬間進(jìn)入色譜柱，結(jié)果溶劑峰就會嚴(yán)重拖尾，使早流出組分的峰被掩蓋在溶劑拖尾峰中[如圖4-3(a)所示]，從而使分析變得困難，甚至不可能。有人也將這一現(xiàn)象叫做溶劑效應(yīng)。

消除這種溶劑效應(yīng)可從幾個(gè)方面考慮，但就載氣的流路來說，主要是采用所謂瞬間不分流技術(shù)。即進(jìn)樣開始時(shí)關(guān)閉分流電磁閥，使系統(tǒng)處于不分流狀態(tài)[圖4-2(b)]。待大部分汽化的樣品進(jìn)入色醉柱后，開啟分流閥，使系統(tǒng)處于分流狀態(tài)[圖4-2(a)]。這樣，汽化室內(nèi)殘留的溶劑氣體(當(dāng)然包括一小部分樣品組分)就很快從分流出口放空，從而在很大程度上消除了溶劑拖尾[如圖4-2(b)所示]。分流狀態(tài)一直持續(xù)到分析結(jié)束，注射下一個(gè)樣品時(shí)再關(guān)閉分流閥。所以我們說，不分流進(jìn)樣并不是不分流，而是分流與不分流的結(jié)合。這里，確定一個(gè)瞬間不分流時(shí)間(從進(jìn)樣到開啟分流閥的時(shí)間)往往是分析成敗的關(guān)鍵。原則上講，這一時(shí)間應(yīng)足夠長。以保證絕大部分樣品進(jìn)人色譜柱，避免分流歧視的影響；同時(shí)又要盡可能短，以更大限度地消除溶劑搶尾、使早流出峰的分析更為準(zhǔn)確。這顯然是有矛盾的。在實(shí)際工作中，常常是根據(jù)樣品的具體情況(如溶劑沸點(diǎn)、待測組分沸點(diǎn)和濃度等)或操作條件來確定一個(gè)優(yōu)化的折衷點(diǎn)。研究結(jié)果表明，這一時(shí)間值一般在30～80S之間。文獻(xiàn)報(bào)道多采用0.75min，即從進(jìn)樣到開啟分流閥的時(shí)問為0.75min，通常能保證95%以上的樣品進(jìn)入色譜柱，本節(jié)后而將介紹如何用實(shí)驗(yàn)方法確定優(yōu)化的不分流時(shí)間。
襯管的尺寸是影響不分流進(jìn)樣性能的另一個(gè)重要因素。為了使樣品在汽化室盡可能少地稀釋，從而減小初始譜帶寬度，襯管的容積小一些有利，一般為0.25～1mL，且更好使用直通式襯管。當(dāng)用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，因進(jìn)樣速度快，樣品揮發(fā)快，故建議采用容積稍大一些的直通式襯管。對于干凈樣品，襯管內(nèi)可不填充玻璃毛，對于相對臟的樣品，則需要填充玻瑞或石英毛，以保證分析的重現(xiàn)性并保護(hù)色譜柱不被污染。但要注意，由于不分流進(jìn)樣時(shí)樣品在汽化室滯留的時(shí)間比分流進(jìn)樣時(shí)長，熱不穩(wěn)定化合物的分解可能性也大，故襯管和其中填充的石英毛都必須經(jīng)硅烷化處理，且要及時(shí)清洗，更換和重新硅烷化。

(二)樣品的適用性
不分流進(jìn)樣具有明顯高于分流進(jìn)樣的靈敏度，它通常用于環(huán)境分析(如水和大氣中痕量污染物的檢測)、食品中的農(nóng)藥殘留監(jiān)測，以及臨床和藥物分析等。這些藥品往往都比較臟，所以樣品的預(yù)處理是保護(hù)色譜柱所必須注意的問題。此外，待測痕量組分如果在溶劑拖尾處出蜂，還可采用溶劑聚焦的方法來提高分析靈敏度。

不分流進(jìn)樣對樣品溶劑有較嚴(yán)格的要求。因?yàn)檫M(jìn)樣口溫度、色譜柱初始溫度、瞬間不分流的時(shí)間和進(jìn)樣體積都與溶劑沸點(diǎn)有關(guān)。一般地講，使用高沸點(diǎn)溶劑比低沸點(diǎn)溶劑有利，因?yàn)槿軇┓悬c(diǎn)高時(shí)，容易實(shí)現(xiàn)溶劑聚焦，且可使用較高的色譜柱初始溫度，還可降低注射器針尖歧視以及汽化室的壓力突變。表4-2列出了常見的溶劑及其沸點(diǎn)和實(shí)現(xiàn)溶劑聚焦宜采用的色譜柱初始溫度。

另一方面，洛劑的極性一定要與樣品的極性相匹配，且要保證溶劑在所有被測樣品組分之前出峰，否則早流出的峰就會被溶劑的大峰掩蓋。同時(shí)，溶劑還要與固定相匹配，才能實(shí)現(xiàn)有效的溶劑聚焦。必要時(shí)可采用保留間隙管來達(dá)到聚焦的目的。
對于高沸點(diǎn)痕量組分的分析，不分流進(jìn)樣就容易多了。此時(shí)可以不考慮溶劑的沸點(diǎn)，因?yàn)橛兄芏ㄏ嗑劢咕屯?保證窄的初始譜帶，采用高的初始柱溫還可縮短分析時(shí)間。事實(shí)上，不分流進(jìn)樣應(yīng)是分析高沸點(diǎn)痕更組分的*方法。
(三)操作參數(shù)設(shè)置
(1)進(jìn)樣口溫度 進(jìn)樣口溫度的設(shè)置可以比分流進(jìn)樣時(shí)稍低一些，因?yàn)椴环至鬟M(jìn)樣時(shí)樣品在汽化室滯留時(shí)問長，汽化速度稍慢一些不會影響分離結(jié)果，還可通過溶劑聚焦和/或固定相聚焦來補(bǔ)償汽化速度慢的問題。不過，進(jìn)樣口溫度的低限是能保證待測組分在瞬間不分流時(shí)*汽化，否則，過低的進(jìn)樣口溫度會造成高沸點(diǎn)組分的損失，影響分析靈敏度和重現(xiàn)性。當(dāng)然，過高的溫度又會造成樣品的分解。因此，要根據(jù)樣品的具體情況優(yōu)化進(jìn)樣口溫度。而當(dāng)改變進(jìn)樣口溫度后，又必須重新優(yōu)化設(shè)置瞬間不分流時(shí)間:.
(2)載氣流速 從減小初始譜帶寬度的角度考慮，不分流進(jìn)樣的載氣流速應(yīng)當(dāng)高一些，其上限應(yīng)以保證分離度為準(zhǔn)。分流出口的流量(開啟分流閥后)一般為30～60mL/min。只要開啟分流閥的時(shí)間設(shè)置正確，分流出口流更在此范圍內(nèi)變化對分析結(jié)果的影響很小。 
(3)進(jìn)樣量和進(jìn)樣速度 進(jìn)樣量一般不超過2μL。進(jìn)樣量大時(shí)應(yīng)選用容積大的襯管，否則會發(fā)生樣品倒灌。進(jìn)樣速度則應(yīng)快一些，更好用自動(dòng)進(jìn)樣器。若采用手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣速度的重現(xiàn)性會影響分析結(jié)果。
(4)瞬間不分流時(shí)間的實(shí)驗(yàn)確定方法 如前文所述，瞬間不分流時(shí)間(也有人叫分流延遲時(shí)間、溶劑吹掃時(shí)間)的確定依賴于樣品和溶劑的性質(zhì)，襯管的容積、進(jìn)樣更，進(jìn)樣速度以及載氣流速。所以這一時(shí)問的確定應(yīng)在其余所有條件都確定之后進(jìn)行。下面介紹一個(gè)簡單的實(shí)驗(yàn)確定方法。
首先將這一時(shí)間設(shè)置長一些(90～120s)，以保證全部樣品組分進(jìn)入色譜柱。對樣品進(jìn)行分析之后，選擇一個(gè)待測組分的峰面積(該峰的k值應(yīng)大于5)作為測定指標(biāo)，該峰面積值就代表100％的樣品進(jìn)入
了色譜柱。
然后逐步縮短不分流時(shí)間(如70, 50, 30s)分別進(jìn)樣分析，計(jì)算同一組分在不同溶劑吹掃時(shí)間條件下的峰面積與*次分析的峰面積之比，直到此比值小于0.95,此時(shí)的不分流時(shí)間為更短時(shí)間。
更后，再進(jìn)一步微調(diào)不分流時(shí)，使同一組分的峰面積達(dá)到*次分析時(shí)峰面積的95%-99％，此時(shí)的吹掃時(shí)間即為更佳條件。
對于高沸點(diǎn)樣品，不分流時(shí)間長一些有利于提高分析靈敏度。而不影響測定準(zhǔn)確度；對于低沸點(diǎn)樣品。則要盡可能使不分流時(shí)間短一些，更大限度地消除溶劑拖尾，以保證分析準(zhǔn)確度。對于熱不穩(wěn)定的化合物，更好用下節(jié)將要介紹的冷柱上進(jìn)樣技術(shù)。氣相色譜儀