測(cè)量時(shí)樣品一般使用血清或者血漿，但是這種樣品對(duì)研究應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)來說卻存在許多問題，例如：取樣過程中的捕捉、麻醉、取樣前是否進(jìn)食、取樣前短時(shí)間內(nèi)環(huán)境變化引起的躁動(dòng)及皮質(zhì)醇的晝夜節(jié)律變化都會(huì)對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激實(shí)驗(yàn)造成干擾。
在動(dòng)作敏捷、個(gè)體較大的群養(yǎng)動(dòng)物應(yīng)激研究中，問題更為突出：如多次采血帶來的動(dòng)物福利問題；由于不能在短時(shí)間內(nèi)捕捉到動(dòng)物，捕捉時(shí)目標(biāo)動(dòng)物和同籠的其他動(dòng)物所受到的應(yīng)激影響；多次重復(fù)捕捉給動(dòng)物帶來的影響。這些問題都可能會(huì)影響應(yīng)激相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信性，阻礙了個(gè)體較大的群養(yǎng)動(dòng)物（如獼猴——一種非常好的人類疾病研究模型）的應(yīng)激研究。因此，取樣技術(shù)的選擇在應(yīng)激研究中顯得尤其重要。
為了避免這些問題，毛發(fā)樣品是一種很好的選擇，血液里的物質(zhì)可以通過毛細(xì)血管滲透到毛囊細(xì)胞，后擴(kuò)散到毛發(fā)里。因此，從毛發(fā)中可以提取出皮質(zhì)醇。
1、毛發(fā)提取過程
樣品粉碎是提取毛發(fā)皮質(zhì)醇非常關(guān)鍵的一步，從相關(guān)文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)Davenport等對(duì)這一步驟的改進(jìn)：起初為剪碎，后來使用了德國(guó)萊馳MM200 進(jìn)行研磨粉碎。我們使用了德國(guó)萊馳MM400，并在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上做了一定改進(jìn)：將樣品放入液氮內(nèi)充分冷凍變脆后，再進(jìn)行研磨，這樣既可以使研磨粉末更細(xì)、更均勻，又可以避免研磨過程中局部高溫對(duì)樣品造成的影響。
終用甲醇進(jìn)行提取。
具體操作步驟：
（1）稱取 500 mg毛發(fā)樣品置于 15 mL玻璃試管中，加入10 mL異丙醇。在室溫下將該試管放于調(diào)速多用振蕩器上洗滌 3 min（頻率 100 次/min），共洗滌 2 次；洗滌后的樣品置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)，37℃干燥 8 h。
（2）干燥后將樣品放入 80 mL小燒杯內(nèi)，用手術(shù)剪剪碎。之后放入 25 mL不銹鋼研磨罐內(nèi)（內(nèi)有 15 mm不銹鋼研磨球一個(gè)），擰緊后將罐放入液氮內(nèi)冷凍至液氮停止沸騰。將研磨罐裝入冷凍混合型球磨儀MM400，研磨 2.5 min（頻率 26 Hz）。
（3）稱取400 mg毛發(fā)粉末a，置于 10 mL離心管內(nèi)，并加入 8 mL甲醇。室溫下，將離心管置于振蕩器，振蕩 24 h（頻率 230 次/min），提取皮質(zhì)醇。
（4）將離心管離心 5 min（離心力 12 000 g,），取 4 mL上清液移入 5 mL離心管內(nèi)。
（5）在 5 mL離心管內(nèi)取 2 mL上清液放入2 mL離心管，室溫用氮?dú)饬鬟M(jìn)行干燥，樣品干燥后，加入 5 mL離心管內(nèi)的剩余樣品，繼續(xù)干燥（隨著甲醇的揮發(fā)，離心管內(nèi)出現(xiàn)懸浮物。我們對(duì)這些懸浮物進(jìn)行了研究）。
（6）干燥后加入 0.5 mL PBS (磷酸緩沖液：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2 HPO4 1.44 g, KH2 PO4 0.24 g，加去離子水定容至 1 L，將pH值調(diào)整到7.4)對(duì)樣品進(jìn)行重構(gòu)。振蕩混勻后，放入−20℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存至檢測(cè)日。
2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
(1)為排除離心管和 PBS (磷酸緩沖液)帶來的假陽(yáng)性，我們將 0.5 mLPBS 放入離心管進(jìn)行了放免檢測(cè)(n=3)。
(2)離心管壁可能會(huì)吸附皮質(zhì)醇，對(duì)皮質(zhì)醇濃度測(cè)量造成影響，為檢測(cè)這種影響，我們將重構(gòu)后的樣品的 1/2 移入新管，如果有吸附作用，則新管(n=10)中樣品由于經(jīng)過了兩次吸附，皮質(zhì)醇濃度應(yīng)低于原管(n=10)。
(3)為了檢驗(yàn)懸浮物對(duì)測(cè)量結(jié)果是否有影響，我們對(duì)同一樣品的濁液(n=10)和清液(n=10)進(jìn)行了比較。
(4)為了保證實(shí)驗(yàn)操作的可靠性，我們對(duì)其中一批樣品(n=16)在不同時(shí)間進(jìn)行了兩次放免測(cè)量。對(duì)同一只動(dòng)物(n=16)的兩個(gè)樣品，不同時(shí)間做了同樣的處理。(5)為了證明毛發(fā)中的皮質(zhì)醇可以反映動(dòng)物受到的應(yīng)激大小，我們對(duì)毛發(fā)中的皮質(zhì)醇濃度與動(dòng)物受到的攻擊量(n=16)進(jìn)行了相關(guān)分析。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4、討 論
整個(gè)提取過程中，離心管和 PBS 并沒有對(duì)樣品造成假陽(yáng)性。這說明樣品皮質(zhì)醇來源于毛發(fā)，而不是污染。離心管壁沒有吸附皮質(zhì)醇，因此不會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)的可靠性造成影響。重構(gòu)后樣品是一種濁液，難以分離，不過我們實(shí)驗(yàn)證明樣品里的懸浮物對(duì)結(jié)果不會(huì)造成影響，不需要分離。然而，我們建議檢測(cè)前將樣品混勻。同一樣品兩次測(cè)量的結(jié)果，其高度相關(guān)性表明了放免檢測(cè)操作過程穩(wěn)定，重復(fù)性好，測(cè)量結(jié)果可信。同一動(dòng)物兩個(gè)樣品間的高度相關(guān)性為我們整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作的可靠性提供了證據(jù)，同時(shí)也說明同一動(dòng)物鄰近毛發(fā)的皮質(zhì)醇含量高度相關(guān)。受到的攻擊量雖然是血漿中皮質(zhì)醇濃度的間接指標(biāo)，但是它與毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度的中度相關(guān)性，以及我們實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)皮質(zhì)醇含量范圍的一致性(Davenport et al，2006)，都說明了我們確實(shí)提取到了毛發(fā)中的皮質(zhì)醇，數(shù)據(jù)可信，同時(shí)毛發(fā)皮質(zhì)醇可以作為衡量應(yīng)激刺激大小的指標(biāo)。由我們的經(jīng)驗(yàn)及測(cè)量得到的樣品皮質(zhì)醇含量低值和試劑盒的靈敏度大致可以推算出：在獼猴毛發(fā)皮質(zhì)醇提取實(shí)驗(yàn)中，為得到足夠濃度，毛發(fā)樣品量不宜低于 200 mg。
總結(jié)：毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度可以作為衡量慢性應(yīng)激刺激大小的指標(biāo)。
文中使用的研磨設(shè)備——
德國(guó)RETSCH(萊馳)冷凍混合球磨儀MM400
冷凍混合型球磨儀MM400是一臺(tái)臺(tái)式多功能儀器。它主要運(yùn)用于小量樣品的干磨、濕磨以及低溫研磨。
它能在幾秒鐘內(nèi)就可以達(dá)到混合、均化粉末和懸浮物的目的。此外，混合型球磨儀還特別適合用于生物細(xì)胞破壁以及DNA/RNA的收集。MM400以其*的性能和高超的靈活度而成為實(shí)驗(yàn)室的*的儀器。
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