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飼料中三聚氰胺的檢測(cè)方案

閱讀:1571        發(fā)布時(shí)間:2011-6-9

檢測(cè)原理:

       酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量測(cè)定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進(jìn)行免疫測(cè)定。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物,樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中,樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體,孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。再用去離子水清洗結(jié)束后,每孔中加入清澈的底物溶液,結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng),根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

 需要準(zhǔn)備的材料:

1、蒸餾水或去離子水
2、可吸取50ul100ul的移液器及吸頭
3、4000轉(zhuǎn)離心機(jī)
4、吸水紙或相當(dāng)?shù)奈牧?/font>
5、450nm的酶標(biāo)儀
6、計(jì)時(shí)器
7、20mM PBS:需自行配制
8、清洗液:需自行配制

試劑配制:

120mM PBS: 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl,蒸餾水定容至1000ml
2、清 洗 液: 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl,蒸餾水定容至1000ml.+0.5ml 土溫20

樣品的前處理:    飼料(稀釋倍數(shù):20

1、稱1g飼料樣品,加入4ml甲醇;
2、震蕩1min,加入0.1g氯化鈉;
3、4000轉(zhuǎn)離心5min;
4、取上清液0.2ml加入到0.8ml20mMPBS中,混勻;
5、取150ul測(cè)定。

測(cè)定過程:

1、將所有試劑及樣品回升至室溫20-28℃,但不要放置超過24小時(shí);
2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條固定在微孔板架上,未使用的孔條與干燥劑一同放入密封袋中保存;
3、吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)品、樣品到對(duì)應(yīng)微孔中,必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取,避免交叉污染。加入
50ul三聚氰胺酶標(biāo)記物到每個(gè)小孔中;
4、輕輕搖板60秒,20-28攝氏度下孵育30分鐘;
5、將微孔中的溶液倒入水槽中,用清洗液*充滿微孔,震蕩后倒掉,重復(fù)三次,總共四次洗板;
6、zui后一次清洗完后,倒掉孔中溶液,然后翻轉(zhuǎn)微孔板在吸水紙上拍干;
7、每個(gè)微孔中加入100ul底物溶液;
8、20-28攝氏度下,孵育30分鐘;
9、每個(gè)微孔中加入100ul停止液;
 10、450nm下讀板

 

 

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