分光光度計的特點與保養(yǎng)維護

分光光度計的特點與保養(yǎng)維護

分光光度計的特點

*的雙光路、雙光束光學(xué)系統(tǒng)，儀器分辨率更高，雜散光更低，穩(wěn)定性、可靠性更強，分析更加準(zhǔn)確采用320*240位點陣式高亮6 ”液晶顯示器，顯示清晰，信息完備*的長光程光路設(shè)計，使儀器分辨率更高，尤其適合微量測試強大的數(shù)據(jù)處理功能，使測試結(jié)果能得到充分的應(yīng)用，用戶編輯更為簡單快捷

采用懸架式光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計，整體光路獨立固定在16mm厚的鋁制無變形基座上，底板的變形和外界的震動對光學(xué)系統(tǒng)不產(chǎn)生任何影響，從而大大提高了儀器的穩(wěn)定性和可靠性采用同步正弦機構(gòu)，波長準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好采用ARM系統(tǒng)0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0六檔光譜帶寬自動可選，滿足不同用戶的測量需求24位高速、高精度A/D轉(zhuǎn)換，儀器精度更高、反應(yīng)速度更快主要元件采用進口配置，使儀器雜散光更低、穩(wěn)定性、可靠性更強功能更加強大，主機可獨立完成光度測量、定量測量、光譜掃描、動力學(xué)、DNA/蛋白質(zhì)測試，多波長測試及數(shù)據(jù)打印等功能充分考慮不同用戶的使用習(xí)慣，本系列儀器都標(biāo)配元析公司光譜掃描軟件，聯(lián)機操作時，除能實現(xiàn)主機的所有測試功能外，還可實現(xiàn)更為強大的數(shù)據(jù)處理功能，并且使數(shù)據(jù)存儲達(dá)到無限

■儀器指標(biāo)

型號UV-9000波長范圍190-900nm光譜帶寬0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0nm六檔可選波長準(zhǔn)確度±0.1nm（D2 656.1nm）， ±0.3nm全區(qū)域波長重復(fù)性≤0.1nm 

光度準(zhǔn)確度

±0.2%T光度重復(fù)性≤0.1%T雜散光≤0.01%T穩(wěn)定性±0.0004A/h（500nm處）基線平直度±0.001A噪聲水平 ±0.0004A/h光度范圍0-200%T、-4.0-4.0A、0-9999C數(shù)據(jù)輸出USB接口光學(xué)系統(tǒng)雙光束、*光柵顯示系統(tǒng)320*240位高亮6"大屏幕LCD光源進口長壽命鎢燈、氘燈檢測器*檢測器外形尺寸635*440*210mm電源AC 220V/50Hz或110V/60Hz重量30kg技術(shù)參數(shù)波長范圍：320∽1000nm光譜帶寬：4nm

雜散光：≤0.5%（在360nm處）

波長準(zhǔn)確度：優(yōu)于±2nm

透射比準(zhǔn)確度：≤±1nmT

常見用途

核酸的定量

核酸的定量是分光光度計使用頻率zui高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

事實上，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。zui后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。 

比色方法

一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

Lowry 法：以zui早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。zui主要的缺點是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。

某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應(yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。

細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）

實驗室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細(xì)胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。

分光光度計的重要配件—— 比色杯

比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應(yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。

由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette?；塑料比色杯，是比色杯市場上一個革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，對此類科學(xué)的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學(xué)實驗室*的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實驗室的*設(shè)備之一。

隨著科技的發(fā)展，比色杯已經(jīng)不是使用分光光度計時的*物品。國外Nanodrop公司（現(xiàn)已被Thermo Fisher公司收購）生產(chǎn)的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比，已經(jīng)可以做到無需稀釋樣品，無需使用比色杯，每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。

操作方法

1.接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10分鐘。

2.將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時，需選用較。）

3.根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕。

4.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對準(zhǔn)光路。

5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向t=0處。

6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，指針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。

7.比色完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。

注意事項

1．該儀器應(yīng)放在干燥的房間內(nèi)，使用時放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上，室內(nèi)照明不宜太強。熱天時不能用電扇直接向儀器吹風(fēng)，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定。

2．使用本儀器前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理，以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應(yīng)該對儀器的安全性能進行檢查，電源接線應(yīng)牢固，通電也要良好，各個調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確，然后再按通電源開關(guān)。

3．在儀器尚未接通電源時，電表指針必須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進行調(diào)節(jié)。

日常維護

分析儀器工作者要懂得儀器的日常維護和對主要技術(shù)指標(biāo)的簡易測試方法，自己經(jīng)常對儀器進行維護和測試，以保證儀器工作在*狀態(tài)。

一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降；造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕，產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等，甚至儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正。應(yīng)具備四季恒濕的儀器室，配置恒溫設(shè)備，特別是地處南方地區(qū)的實驗室。

二、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性，也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件，防塵。

三、儀器使用一定周期后，內(nèi)部會積累一定量的塵埃，由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進行除塵工作，同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固，對光學(xué)盒的密封窗口進行清潔，必要時對光路進行校準(zhǔn)，對機械部分進行清潔和必要的潤滑，zui后，恢復(fù)原狀，再進行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄。

分光光度計的維護保養(yǎng)

分光光度計作為一種精密儀器，在運行工作過程中由于工作環(huán)境，操作方法等種種原因，其技術(shù)狀況必然會發(fā)生某些變化，可能影響設(shè)備的性能，甚至誘發(fā)設(shè)備故障及事故。因此，分析工作者必須了解分光光度計的基本原理和使用說明，并能及時發(fā)現(xiàn)和排除這些隱患，對已產(chǎn)生的故障及時維修才能保證儀器設(shè)備的正常運行。

1)若大幅度改變測試波長，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新校正“0”和“100%”點。然后再測量。

2)指針式儀器在未接通電源時，電表的指針必須位于零刻度上。若不是這種情況，需進行機械調(diào)零。

3)比色皿使用完畢后，請立即用蒸餾水沖洗干凈，并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去，以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率。

4)操作人員不應(yīng)輕易動燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率。

5)1900型等分光光度計，由于其光電接收裝置為光電倍增管，它本身的特點是放大倍數(shù)大，因而可以用于檢測微弱光電信號，而不能用來檢測強光。否則容易產(chǎn)生信號漂移，靈敏度下降。針對其上述特點，在維修、使用此類儀器時應(yīng)注意不讓光電倍增管長時間暴露于光下，因此在預(yù)熱時，應(yīng)打開比色皿蓋或使用擋光桿，避免長時間照射使其性能漂移而導(dǎo)致工作不穩(wěn)。

6)放大器靈敏度換擋后，必須重新調(diào)零。

7)比色杯的配套性問題。比色杯必須配套使用，否則將使測試結(jié)果失去意義。在進行每次測試前均應(yīng)進行比較。具體方法如下；分別向被測的兩只杯子里注入同樣的溶液，把儀器置于某一波長處，石英比色杯；220nm、700nm裝蒸餾水，玻璃比色杯：700nm處裝蒸餾水，將某一個池的透射比值調(diào)至100%，測量其他各池的透射比值，記錄其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范圍內(nèi)則可以配套使用，若超出此范圍應(yīng)考慮其對測試結(jié)果的影響。

分光光度計分操作中容易出現(xiàn)的幾個典型故障及其排除方法：

1)儀器不能調(diào)零?？赡茉颍?/span>

a)光門不能*關(guān)閉。解決方法：修復(fù)光門部件，使其*關(guān)閉。

b)透過率“100%”旋到底了。解決方法：重新調(diào)整“100%”旋鈕。

c)儀器嚴(yán)重受潮。解決方法：可打開光電管暗盒，用電吹風(fēng)吹上一會兒使其干燥，并更換干燥劑。

d)電路故障。解決方法：送修理部門，檢修電路。

2)儀器不能調(diào)“100%”?？赡茉颍?/span>

a)光能量不夠。解決方法：增加靈敏度倍率檔位，或更換光源燈(盡管燈還亮)。

b)比色皿架未落位。解決方法：調(diào)整比色皿架使其落位。

c)光電轉(zhuǎn)換部分老化。解決方法：更換部件。

d)電路故障。解決方法：調(diào)修電路。

3) 測量過程中，“100%”點經(jīng)常變動?？赡茉颍?/span>

a)比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解決方法：用擦鏡紙擦干凈比色皿表面，然后將其安放在比色槽的左邊，上面用定位夾定位。

b)電路故障(電壓、光電接收、放大電路)。解決方法：送修。

4)數(shù)顯不穩(wěn)。可能原因：

a)預(yù)熱時間不夠。解決方法：延長預(yù)熱時間至30分鐘左右(部分儀器由于老化等原因，長時間處于工作狀態(tài)時，也會工作不穩(wěn))。

b)光電管內(nèi)的干燥劑失效，使微電流放大器受潮。解決方法：烘烤電路，并更換或烘烤干燥劑。

c)環(huán)境振動過大、光源附近空氣流速大、外界強光照射等。解決方法：改善工作環(huán)境。

d)光電管、電路等其它原因。解決方法：送修。

五、提高分光光度計透射比檢定及使用精度的幾種方法

在分光光度計的使用或檢定中，透射比(吸光度)的準(zhǔn)確度是衡量儀器工作性能的一項重要指標(biāo)，它的準(zhǔn)確程度直接關(guān)系到所測數(shù)據(jù)的可信性及科學(xué)性。所以提高此項指標(biāo)的使用及檢定準(zhǔn)確度顯得尤為重要。