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FLUOSYNC 一種快速而溫和的多色光譜拆分寬場熒光成像方法

閱讀：1073 發(fā)布時間：2022-2-18
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作者
Johannes Amon博士
Peter Laskey博士，徠卡顯微系統(tǒng)公司
FluoSync 是一種使用單次曝光同時進(jìn)行多通道
熒光成像的精簡方法。
傳統(tǒng)的熒光成像方法通常按順序?qū)γ總€通道成像，以減少熒光團(tuán)之間的串?dāng)_。之前已單獨(dú)介紹了多光譜成像以及后續(xù)的線性拆分或基于相量的光譜拆分方法。每一種方法都需要進(jìn)行繁瑣的手動調(diào)整或深入理解底層技術(shù)，或兩者都需要。徠卡顯微系統(tǒng)通過FluoSync引入了一種綜合方法，在消除復(fù)雜性的同時保留了快速溫和成像的優(yōu)點(diǎn)。FluoSync 會捕捉整個可見光光譜中的光子，與窄帶寬濾光片相比，丟棄的信息更少；然后采用基于相量的混合拆分方法分離每個信號，實(shí)現(xiàn)可靠的通道分離。多通道熒光成像從未如此容易。
多色寬場顯微成像
熒光顯微成像為研究蛋白質(zhì)及其他生物分子的細(xì)胞功能提供了一種強(qiáng)大的工具。它具有能標(biāo)記和跟蹤高特異性靶分子的*能力，因此已成為生命科學(xué)研究中不可少的一種工具。抗體和遺傳標(biāo)記可使用光譜可分辨的熒光染料來靶向和標(biāo)記分子（見圖 1）。通過組合使用這些熒光標(biāo)記，用戶可以跟蹤和研究樣本中不同標(biāo)記的分子群體之間的行為和相互作用。常見的多色熒光成像方法需要考慮到熒光團(tuán)信號的光譜重疊，這種現(xiàn)象通常稱為串?dāng)_或串色，如圖 1b 所示。通常，研究人員可通過將樣本中的染料數(shù)量保持在最少限度（即最多一種或兩種染料）來避免串?dāng)_，因?yàn)闃颖局惺褂玫娜玖显蕉?，發(fā)生信號串?dāng)_問題的可能性就越大。但是，隨著對生物學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)需求的日益增長，研究人員需要在一個樣本中觀察三個或更多事件，因此這種過于簡單的方法不再適用。在典型的多通道實(shí)驗(yàn)中，通常使用一種或兩種熒光染料來識別特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如細(xì)胞核或線粒體，再使用額外的染料來識別感興趣的蛋白質(zhì)。
光譜分離和拆解
在多通道方法中通常需要使用光譜分離良好的染料組合。如圖 1 所示，Alexa 488 與 Alexa 555 的組合就是一個很好的例子，兩者分別在光譜的綠色和紅色部分發(fā)光。但是，在使用多個熒光團(tuán)染色的
樣本中，對染料進(jìn)行光譜分離通常并不容易。染料的發(fā)射曲線可能部分重疊，導(dǎo)致一種染料發(fā)出的部分熒光信號落入其鄰近光譜的探測窗口。換句話說，來自綠色染料的一些信號會串色到紅色通道。在活細(xì)胞成像中這個問題可能更嚴(yán)重，因?yàn)橛脩魹榱吮苊夤舛拘詴L試避開光譜的藍(lán)色端。研究人員仍然需要使用多種染料來標(biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)，但是受限于較窄的光譜區(qū)域，這增加了潛在的串?dāng)_問題。
有兩種常用的方法可對熒光信號進(jìn)行光譜分解：使用特定的窄帶通光學(xué)濾色鏡和線性拆分（也稱為多光譜或高光譜成像）進(jìn)行分離。使用特定的窄帶通光學(xué)濾色鏡進(jìn)行通道分離簡單的多通道方法是按順序?qū)θ玖铣上?。使用這種方法時，單獨(dú)激發(fā)樣本中的每種染料并探測其發(fā)射光。激發(fā)波長通過激發(fā)濾色鏡或特定波長的 LED 進(jìn)行控制。熒光濾色塊中的帶通光學(xué)濾色鏡被移至每個圖像的光路中，以檢查到達(dá)樣本和探測器的光譜。最終的復(fù)合多色圖像是通過疊加單獨(dú)的曝光而產(chǎn)生的。按順序激發(fā)染料有助于減少串?dāng)_問題，但不能*將其消除。這種方法可能太慢，無法對快速的細(xì)胞事件成像，例如囊泡跟蹤或鈣成像。通常，感興趣的對象在兩個通道之間移動，因此如果不同時采集兩個通道，就無法在兩個通道中有效跟蹤該對象。此外，對多孔板等大型樣本成像時，長采集周期會顯著增加實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行時間，導(dǎo)致工作效率下降。
為了加快采集過程，可以使用 Sedat 和 Pinkel 配置，將多帶通熒光濾色塊與快速的濾光片輪結(jié)合使用。這種小型濾光片輪的切換速度比熒光濾色塊快得多。多帶通熒光濾色塊會阻擋來自窄發(fā)射窗口之外的染料的熒光發(fā)射，因此可能會丟失寶貴的信號（參見圖 1a）。該技術(shù)還可能增加樣本光漂白，并降低最終圖像中的時間分辨率和信噪比水平。
線性拆分
另一種分離染料的方法是線性拆分，它使用數(shù)學(xué)拆分方法來分離通道。在這種方法中，顯微鏡收集樣本的多個圖像，每個圖像涉及不同的光譜帶（參見圖 2）。所收集的數(shù)據(jù)包含每個像素的光譜曲線，以及來自所有熒光團(tuán)的組合發(fā)射光譜。接下來使用光譜線性拆分來量化每一群熒光團(tuán)對信號的貢獻(xiàn)，然后生成多通道圖像。在寬場成像中，該技術(shù)稱為多光譜成像。在共聚焦成像中，系統(tǒng)通常可以用較高光譜分辨率進(jìn)行掃描，這種方法稱為高光譜成像或蘭布達(dá)掃描。除非您擁有能夠同時捕捉多個光譜窗口的專用硬件，否則這種方法需要對樣本反復(fù)曝光，導(dǎo)致有的光脅迫，因此不適合活細(xì)胞成像。線性拆分要求樣本中的每種染料有一個已知的參考光譜。理想情況下，使用相同類型的樣本和制備方法采集參考光譜，以便系統(tǒng)能夠?qū)⑷玖闲盘柵c樣本*的背景噪聲和自發(fā)熒光區(qū)分開。線性拆分的基礎(chǔ)是將校準(zhǔn)曲線中的信號水平與從真實(shí)樣本中采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配。如果染料濃度不同，即來自一個通道的信號比另一個通道的亮得多，可能會導(dǎo)致拆分誤差。此外，如果存在探測器或光學(xué)噪聲（樣本背景熒光），還可能導(dǎo)致引入更多誤差來源。這些弱點(diǎn)可能意味著線性拆分不適合光照強(qiáng)度低、背景噪聲高的樣本以及通道之間強(qiáng)度明顯不同的樣本。
圖 1a。 Alexa 488（綠色曲線）和 Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。兩個發(fā)射光譜的重疊顯而易見。紅線表示 488 發(fā)射光濾光鏡的帶通。只有在這條線下擬合的發(fā)射波長才能使其通過濾光鏡到達(dá)探測器。紅色陰影區(qū)域顯示了 488 信號的一部分 (~20%) 被濾光鏡阻擋，減少與相鄰染料發(fā)生串?dāng)_。
圖 1b。圖 1b 中的兩張圖像分別顯示了通道串色（左圖），以及使用帶通光學(xué)濾色鏡抑制這種現(xiàn)象（右圖）。在這種情況下，對微管染色的紅色染料在線粒體圖像中清晰可見，因?yàn)閳D像是使用多帶通熒光濾色塊采集的，但是探測器前面沒有發(fā)射光濾光鏡。紅色染料（微管）與綠色染料（線粒體）交叉激發(fā)，導(dǎo)致通道串色嚴(yán)重。在第二張圖像中，使用正確的發(fā)射光濾光鏡消除了串?dāng)_。
FluoSync
FluoSync 是一種快速、可靠的方法，能拆分來自樣本中多個熒光團(tuán)的信號。它通過相量分析簡化了多光譜成像方法（Cutrale等人，2017 年），與較為傳統(tǒng)的多通道成像方法相比具有多項(xiàng)優(yōu)勢。
FluoSync 通過探測器單次曝光同時激發(fā)和探測所有通道，從而采集多光譜圖像數(shù)據(jù)。此方法所用的探測器采用多個傳感器，每個傳感器采集光譜的不同部分。然后，使用基于相量的混合分解方法將產(chǎn)生的組合數(shù)據(jù)集分解。
由于同時采集所有熒光團(tuán)，因此它比傳統(tǒng)方法的速度更快，成為活細(xì)胞成像和微量滴定板等大型樣本成像的理想解決方案。動態(tài)活細(xì)胞的同時成像得益于圖像采集的速度和高同步性。在采集來自兩個不同熒光團(tuán)的信號之間，囊泡等快速移動對象不會產(chǎn)生位移。功能實(shí)驗(yàn)（例如微量滴定板等較大樣本載體上的活細(xì)胞/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）成像將受益于速度優(yōu)勢，并可將數(shù)據(jù)與另外的標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)，而不需要額外的采集時間。不同于依靠多個帶通熒光濾色塊阻擋部分發(fā)射信號以改善通道分離的方法，F(xiàn)luoSync 使用寬帶濾色鏡收集大部分發(fā)射信號，提供了一種同樣適用于弱光成像的高效探測解決方案。收集的光通過內(nèi)置的光譜分離器進(jìn)行分離。因此，等人認(rèn)為基于相量的分析是一種對熒光壽命顯微成像 (FLI挑選和安裝合適的熒光濾色塊已成為歷史?；谙嗔康墓庾V拆分最初在2008年，Digman M) 進(jìn)行可視化和快速分析的有效方法。后來，F(xiàn)ereidouni 等人和 Cutrale 等人先后在 2012 和 2017 年采用了該方法。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，轉(zhuǎn)換為相量后可將光譜表示在徑向顏色軸上，光譜寬度確定了光譜與原點(diǎn)的距離。兩種純?nèi)玖系幕旌衔飼蔀榧內(nèi)玖现g的一條直線，而與純?nèi)玖系木嚯x代表了對整體信號的相對貢獻(xiàn)。適用于任何兩種染料的情況也適用于更多染料。每種可能的染料組合最終都會落在相量空間中的位置。

圖 2。概括了對含有多種熒光染料的樣本成像時的三種顏色分離方法。通過比較發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)熒光成像方法相比，F(xiàn)luoSync 采集速度更快的優(yōu)勢顯而易見。FluoSync 捕捉受激發(fā)染料的全發(fā)射光譜，因此光子不會被浪費(fèi)，這使它成為敏感活體樣本弱光成像的理想探測技術(shù)。
圖 3。左側(cè)所示為藍(lán)色、綠色和紅色熒光團(tuán)的三個單獨(dú)光譜。使用相量分析時，每個純光譜都落入相量空間中的特定空間，顏色在一個圓圈上表示，信號清晰度決定了與中心（中間面板）的距離。這些熒光團(tuán)的任意組合也將落入特定空間。圖中所示是三個熒光團(tuán)中的每一個與所有三個熒光團(tuán)的混合體的一種組合。由于任何可能的熒光團(tuán)組合也將落入“它們的"空間，因此可將光譜平均化以實(shí)現(xiàn)去噪。右側(cè)圖是一個例子，其中黑線表示平均值 ± 誤差（顯示為灰色區(qū)域）。降噪光譜表示所有貢獻(xiàn)熒光團(tuán)的總和，它很好地填充了曲線下方的面積通過相量來表示光譜信息，可對圖像中的不同熒光組分進(jìn)行實(shí)時、半盲的光譜分解。這種表示方法不僅局限于熒光標(biāo)記，還可以去除自發(fā)熒光等無用信號，因此比線性拆分更加可靠。基于相量的光譜拆分方法適合用于分解最多 3 個熒光團(tuán)的信號。超過 3 個熒光團(tuán)時，相量方法仍然可以輕松識別最大的影響因素。拆分領(lǐng)域的新發(fā)展催生了一種混合拆分方法，它結(jié)合了基于相量的拆分和線性拆分這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)。
對混合光譜拆分的說明
FluoSync 充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優(yōu)勢。相量分析用于相似光譜的快速聚類以及光譜去噪和線性拆分，能夠識別染料對每個聚類的單獨(dú)貢獻(xiàn)，甚至包括超過 3 種染料的情況（圖3）。與單純基于相量的拆分類似，具有相似熒光組分的所有像素都會落入相同的相量空間。因此，無論空間位置（即圖像中的原點(diǎn)位置）如何，它們都可被平均化以實(shí)現(xiàn)光譜去噪。這樣，通過歧管進(jìn)行的線性拆分操作次數(shù)（像素數(shù)，通常在百萬像素級別）通常會減到少于100,000次操作。然后對降噪光譜進(jìn)行線性拆分，由此識別每種染料的亮度值。與線性方法相比，混合拆分方法利用了基于相量的方法所具有的速度和平均化優(yōu)勢，而不會影響可分離染料的數(shù)量。
總結(jié)與優(yōu)勢
FluoSync是光學(xué)濾色鏡的數(shù)字迭代進(jìn)步。這是一種可用于對多種染料成像的可靠方法。由于它只需要單次圖像曝光，并且可以使用自動光譜分解方法完成，因此可以更輕松、更快速地進(jìn)行多色熒光成像。
與傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，F(xiàn)luoSync 提供了高速、同步的多通道采集，同時利用了串?dāng)_而不是避免串?dāng)_。它是掃描大型樣本或捕捉活細(xì)胞快速動態(tài)過程的理想解決方案。最后，使用 FluoSync 時無需在實(shí)驗(yàn)之間管理多組熒光濾色塊，從而簡化了實(shí)驗(yàn)工作流程。因此，您可以專注于獲得結(jié)果，而不是研究顯微鏡。
優(yōu)勢：
> 可使用不同的熒光團(tuán)組合更加自由地進(jìn)行多通道成像：您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
> 提升數(shù)據(jù)生成效率：能同時采集所有事件而無需管理多組濾光鏡，從而加快了圖像采集過程，提高了對多孔板等大型樣本成像的效率，并且能夠捕捉活體樣本中的快
速事件。
> 增強(qiáng)信心：使用混合光譜拆分方法意味著您無需再擔(dān)心串?dāng)_。
參考資料
Digman MA, Caiolfa VR, Zamai M, Gratton E。用于熒光壽命成像分析的相量方法。《生物物理學(xué)雜志》，2008 年Jan 15;94(2):L14-6.
F. Fereidouni, A. N. Bader, H. C. Gerritsen, Opt. Express 2012,20, 12729
Francesco Cutrale, Vikas Trivedi, Le A Trinh, Chi-Li Chiu, John MChoi, Marcela S Artiga & Scott E Fraser. 《自然·方法學(xué)》14,149–152 (2017)
了解更多：徠卡顯微

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