如何提高超薄切片機的切片質(zhì)量
并實現(xiàn)自動對齊功能
超薄切片技術是獲取樣品切片的zui常用方法。在室溫條件制備時，將樣品小塊嵌入環(huán)氧樹脂中，然后通過修剪去除多余的樹脂，并使用玻璃刀或金剛石刀將樣品切成厚度為50-100納米之間的薄片。
切片過程涉及多個手動制備步驟。在本應用說明中，我們將概述該過程，并解釋新的自動化解決方案，如何wanquan消除復雜的手動設置需求。
簡 介
透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）等電子顯微鏡技術，廣泛應用于獲取生物或非生物材料樣品的結構信息。在電子顯微鏡（EM）應用中，較厚的樣品被切割成厚度小于100納米的超薄切片。
該樣品制備方法有助于獲取高分辨率的電子顯微鏡圖像，并且能夠進一步通過計算重建從多個連續(xù)切片中收集的信息，從而獲得較厚樣品的概覽（體積電子顯微鏡學）。
樣品塊的修整
為了獲得具有特定厚度的均勻切片，必須執(zhí)行多個手動步驟，并具備相應的技能和專業(yè)知識。
粗 修
在切割感興趣區(qū)域之前，必須對樣品進行初步修整，以露出目標點，并去除過量的無樣品聚合物或非目標樣品區(qū)域。通常，修整的結果是形成（堆疊的）金字塔形狀，其尺寸逐漸減?。▓D1）。
圖1：經(jīng)過粗修和精修后的樣品塊。放大圖顯示了聚合物塊前端上的樣品面。聚合物塊前端面使用銑削裝置，以45°的形狀進行修整。使用超薄 切片機和具有45°邊緣的切片刀對塊面進行修整，形成金字塔形狀。
首先，粗修是通過手動使用刀片或使用EM RAPID來制備金字塔截體。EM RAPID的高速金剛石銑削頭，可以以特定角度朝向樣品，同時樣品在四輪中能夠進行90°旋轉(zhuǎn)（圖2）。
圖2：使用EM RAPID銑削裝置對樣品塊進行粗修。左：修整前的樣品塊。中：銑削第二個區(qū)域。右：最終粗修后的樣品。
精 修
接下來，將樣品塊安裝在超薄切片機上，并使用修塊刀減小樣品區(qū)域并塑造其形狀，以形成最終的切面。精修的目的是將樣品感興趣區(qū)域包含在小于1平方毫米的矩形或梯形區(qū)域內(nèi)，并使上下邊緣與切片刀wanquan平行（圖3），這將在后續(xù)步驟中允許切片彼此粘附形成帶狀。帶狀切片可以整體收集，使用戶能夠按照切片的順序進行拍攝，這對于陣列斷層掃描應用尤其重要。
圖3：使用金剛石修塊刀進行精修。左：粗修后的樣品塊。中：精修前樣品塊的前端。下方可見一把45°金剛石修塊刀。右：樣品塊面的前端和右側(cè)已經(jīng)進行了精修。
樣品與切片刀之間對齊
在對樣品塊進行修整以獲得平坦且暴露的塊面后，將其正確對齊到切片刀邊緣至關重要。最終目標是使樣品與切割平面之間的距離盡可能小，以避免樣品材料損失和切片不完整。
wanmei對齊樣品和切片刀是一項具有挑戰(zhàn)性的任務。它需要精密地手動調(diào)整樣品傾斜、旋轉(zhuǎn)和切片刀角度，同時需要正確地控制樣品進給（進刀）。
這對于新手或不常使用超薄切片機的用戶來說尤其困難。不僅存在損壞昂貴切片刀的風險，而且還可能損壞樣品，無法用于切片。即使經(jīng)驗豐富的操作人員也需要小心謹慎，以確保在較薄樣品（如細胞單層）切片過程中，不會因初始位置未對齊，而損失太多材料。
方 法
為了判斷切片刀與樣品之間的距離，用戶需要使用底照光來觀察它們之間的間隙，整個過程在體視顯微鏡下進行。底照光從下方照亮切片刀的背面，并通過樣品塊面的光滑表面反射光線，呈現(xiàn)為一條明亮的條紋（圖4）。這被稱為“光隙"。
wanmei對齊表現(xiàn)為在整個塊面長度上均勻?qū)挾鹊谋。ㄋ{色）光隙（見下文）。
圖4：切片刀背面在樣品塊面上的反射圖像。左：概覽圖，底照光被切片刀的背面反射至樣品塊面，幾乎照亮了整個前端面。右：用切片刀接近樣品時，塊面上的反射光變成小條紋，稱為光隙。光隙是指示切片刀與塊面之間方向的工具。
以下步驟通常以迭代順序執(zhí)行，直到塊面和切片刀對齊為止。通常，兩者之間的距離可以小于500納米。
樣品旋轉(zhuǎn)
為確保切片能夠彼此粘附并形成帶狀，切片的上下邊緣必須wanquan平行。這只有在整個塊面與切片刀wanquan接觸時才能實現(xiàn)。因此，必須旋轉(zhuǎn)樣品以使其與切片刀邊緣平行（圖5）。
圖5：調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn)。左：樣品旋轉(zhuǎn)與切片刀邊緣的示意圖。中：樣品未正確旋轉(zhuǎn)。右：樣品正確對齊到切片刀。
首先，將切片刀座移至足夠接近樣品的位置，以產(chǎn)生光隙。一旦在塊面上觀察到光隙，用戶需要調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn)，使塊面下邊緣與切片刀平行。如果未調(diào)整切片刀角度，可能無法使樣品和切片刀平行，因為塊面尚未被修塊刀修整。
切片刀角度
為了補償塊面表面與切片刀之間的角度，需要旋轉(zhuǎn)切片刀，直到塊面的前導邊緣與切片刀平行（圖6）。這將確保樣品從左到右的整個區(qū)域與切片刀接觸，從而提供完整的切片，不會損失太多樣品材料。此外，上述操作確保樣品切割均勻，并使切片能夠彼此粘附，在切片刀水槽中形成條帶（圖6，下圖）。
圖6：調(diào)整切片刀角度。左上：切片刀和樣品塊面的示意圖。藍色切片刀以其邊緣與塊面平行的方式轉(zhuǎn)動。中上圖像：底照光照亮的塊面圖像。切片刀邊緣在圖像底部可見為黑色條紋。切片刀邊緣必須與塊面的下邊緣平行，但在這里并非如此。右上圖像：調(diào)整切片刀角度，使其與塊面邊緣平行。下圖像：切片在切片刀水槽中形成條帶。切片具有wanquan平行的邊緣，因此彼此粘附。
樣品傾轉(zhuǎn)
樣品傾轉(zhuǎn)是最關鍵但不易觀察的影響參數(shù)之一。如果樣品傾轉(zhuǎn)不正確，切片刀在切割過程中將不會與樣品運動保持一致。因此，在獲得完整切片之前，可能會丟失珍貴的樣品。
通過弧形樣品夾以調(diào)整塊面與切片刀邊緣之間的角度，可以調(diào)節(jié)樣品傾轉(zhuǎn)。以光隙為指標，用戶在調(diào)整過程中需要上下移動樣品，直到光隙在整個塊面上顯示相同的厚度（圖7）。
這需要通過迭代方法來調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)。在這個階段，切勿將切片刀太靠近樣品，否則塊面的離切片刀較近部分可能會被wanquan切掉，從而有損失整個樣品的風險。同時，也存在切片刀損壞的風險。
圖7：調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)。左：樣品傾轉(zhuǎn)原理的示意圖。樣品傾轉(zhuǎn)，直到塊面表面沿切割運動方向與切片刀邊緣對齊。中：上下移動樣品時的兩個光隙圖像。灰色條紋的厚度不同。右：調(diào)整后的光隙。
以光隙為作為調(diào)整的指標
樣品和切片刀角度調(diào)整的最后一步是使用光隙作為指標進行調(diào)整。在調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)之后，小心地將切片刀朝樣品推進，直到切片刀與塊面之間的光隙幾乎看不見。在接近過程中，光隙的顏色會發(fā)生變化，直到最終變?yōu)樗{色（顏色的變化是衍射的結果，圖8）。使用這種方法，在整個塊面上對齊偏差能夠小于1µm。從塊面反射出的藍色光隙，通常表示塊面與切片刀之間的距離約為400納米。在此距離下，在所有角度上均勻分布的光隙是zui精確指標，盡可能減小材料的損失。
圖8：精細調(diào)整過程中，切片刀與塊面之間衍射產(chǎn)生的藍色光隙。
圖9：帶有電動切片刀架（1）和弧形樣品夾（2）的UC Enuity
內(nèi)置的flexacam（i5或c5）相機，提供了切片刀和光隙的圖像，這些圖像會被分析，并將信息發(fā)送回來，以進行自動對齊工作（圖10）。
圖10：內(nèi)置flexacam i5相機和觸摸屏截圖，顯示帶有自動對齊反饋線的圖像（也見下文）。
對齊過程會引導用戶完成接近階段，最終對齊步驟將自動完成。這種自動化設計旨在保護切片刀和塊面免受損壞，同時幫助用戶實現(xiàn)wanmei對齊。該功能幫助未經(jīng)過培訓的用戶，如在核心設施或研究組內(nèi)工作的用戶，在切片刀和樣品的初始定位階段，在不承擔損壞風險的情況下獲得高質(zhì)量切片。
需要注意的是，要執(zhí)行wanquan自動對齊功能，必須滿足某些先決條件。例如，塊面尺寸必須至少為250 x 250µm，最大為1200 x 1200µm。此外，塊面必須具有反射性且足夠干凈。
自動化工作流程
開始自動對齊程序前，首先應將切片刀接近塊面并居中。在用戶確認后，將執(zhí)行自動對齊功能（圖11）。
圖11：UC Enuity顯示屏截圖，顯示檢測光隙步驟中的相關交互按鈕（左）。自動對齊過程中的相機圖像（右）。反饋線指示圖像中是否檢測到正確的邊緣。綠色：垂直中心線；洋紅色：光隙的上邊緣；白色：光隙的下邊緣（此處不可見，與紅線重合）；紅色：切片刀邊緣；藍色：自動檢測到的塊面左邊緣和右邊緣。
軟件檢測圖像中的不同邊緣，并對切片刀角度、樣品傾斜和樣品旋轉(zhuǎn)進行迭代對齊。在此過程中，樣品會上下?lián)u動，以觀察分析整個塊面范圍的光隙，并據(jù)此調(diào)整樣品傾斜。
在過程結束時，可以自動將切片刀接近樣品，直到大約5µm的距離（圖12）。如果需要，也可以進行手動校正。
圖12：切片刀接近樣品，安全距離約為5µm。左：對齊后，用戶可以決定自動或手動接近樣品。右：接近后的光隙。將保持約5µm的安全距離。
多組測試結果
對齊過程的目的是避免在獲得完整切片之前，不必要地損失部分樣品區(qū)域。為了提供確鑿的證據(jù)，證明自動對齊功能能夠可靠地產(chǎn)生高質(zhì)量切片，我們對樣品進行了一系列超薄切片測試。
在第一組代表性樣品中，專家手動進行了對齊。通常，專家需要切割5-10個厚度為100nm的部分切片，直到獲得完整切片。另一組樣品使用UC Enuity的自動對齊功能進行修塊，其中五個不同樣品使用不同設備進行修塊，樣品塊面尺寸不同。在兩組測試中，部分切片的平均數(shù)量均低于或等于10，而最少部分切片的數(shù)量在3到7之間（表2）。這證明使用UC Enuity可以成功實現(xiàn)自動對齊。
表2：使用UC Enuity自動對齊后獲得完整切片所需的部分切片數(shù)量。
測試1，n=4；測試2，n=2；測試3，n=4；測試4，n=7；測試5，n=2。
在超薄切片中，切片刀和樣品的對齊，對于實現(xiàn)高質(zhì)量切片和減少獲得完整切片前的樣品材料損失至關重要。
由于對齊過程較為復雜，手動操作時需要用戶具備豐富經(jīng)驗，因此UC Enuity提供的自動對齊解決方案，有助于減少非熟練和不常用戶對樣品或切片刀造成損壞的風險。UC Enuity還幫助他們實現(xiàn)wanmei的光隙調(diào)整，為高質(zhì)量的切片提供了基礎。
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