樣品處理通常是光片顯微鏡研究中的一個(gè)關(guān)鍵話題。徠卡顯微系統(tǒng)的TCS SP8 DLS將光片技術(shù)集成到倒置共聚焦平臺(tái)中，因此可以利用關(guān)于樣品安裝和XY-stage功能的一般原則。本文將描述一組安裝框架，這些框架不僅允許準(zhǔn)備更多的樣品，尤其是在使用諸如BABB（苯甲醇苯甲酸酯）等潛在有害的安裝介質(zhì)時(shí)，亦具有廣泛的適用性。
樣品架：
這里介紹的樣品架是為數(shù)字光片（DLS）成像設(shè)計(jì)的，但同樣適用于傳統(tǒng)的直立式和倒置式顯微鏡成像。
簡介：
在使用SP8 DLS模塊進(jìn)行成像時(shí)，樣品被放置在TwinFlect鏡子之間。
X方向的移動(dòng)范圍由所使用的TwinFlect鏡子的距離（2.5毫米、5毫米或7.8毫米）決定。最大移動(dòng)范圍大約是鏡子之間距離的一半。
圖 1：由 TwinFlect 鏡子定義的 x 方向移動(dòng)范圍。y 方向的移動(dòng)范圍由安裝盤的大小決定。
Y方向的移動(dòng)范圍則由樣品架的形狀和大?。ㄈ缗囵B(yǎng)皿）決定。
對于標(biāo)準(zhǔn)的35毫米培養(yǎng)皿（玻璃底直徑20毫米），Y方向的移動(dòng)范圍相對有限，不會(huì)接觸到皿的邊緣：
圖 2：使用標(biāo)準(zhǔn) 35 毫米培養(yǎng)皿時(shí) y 方向的受限移動(dòng)范圍。
使用矩形24 x 50毫米蓋玻片的樣品夾時(shí)，Y方向的移動(dòng)范圍增加，使得可以使用更大或更長的樣品。此外，這種設(shè)計(jì)還能夠增加在一次實(shí)驗(yàn)中成像的樣品數(shù)量，非常適合多位置實(shí)驗(yàn)。
圖 3：矩形 24 x 50 mm 蓋玻片在 y 方向上的行程范圍增加。
材料與方法
安裝框架套件（#158007063）包含一個(gè)用于24 x 50毫米玻璃蓋玻片的樣品夾，以及一個(gè)用于直徑30毫米圓形蓋玻片的樣品夾。請注意，玻璃蓋片不包含在內(nèi)。
圖 4：安裝框架套件（樣品夾矩形 24 x 50 mm + 直徑 30 mm 的圓形樣品夾）
24 x 50 mm 蓋玻片的樣品夾僅與以下 z-Galvo 載物臺(tái)插入件兼容：
158004118 可旋轉(zhuǎn)插入件反向
158004119 通用插入件
封閉樣品架/附加玻璃蓋片
對于在水溶液中的成像，可以使用硅膠（如Elastosil® 43，Wacker）或雙組分Twinsil®來附加玻璃蓋片。
這些樣品架也適用于在更具侵蝕性的溶液中成像，例如BABB（苯甲醇/苯甲酸芐酯）。由于BABB可以溶解多種材料，因此需要使用專門類型的硅膠來密封容器，例如Elastosil® E41（Wacker）（與德國維爾茨堡大學(xué)魯?shù)婪颉ぞS爾喬中心的尤爾根·皮內(nèi)克的個(gè)人溝通）。
1
在樣品架底部的凹槽內(nèi)緣涂抹硅膠/雙硅膠。
2
添加一片玻璃蓋片，并輕輕按壓以確保其均勻貼合，以便在所有點(diǎn)上形成良好的密封。
3
要檢查腔體密封，請?jiān)跇悠芳苤屑尤胍恍┱麴s水，看看是否有泄漏發(fā)生。
上樣
在組裝好帶有相應(yīng)玻璃蓋片的安裝框后，您可以選擇以下不同的樣品安裝方式：
基于瓊脂糖的上樣
1
在蓋片表面覆蓋一層薄薄的瓊脂糖（0.5-1毫米），待其聚合后，形成樣品的支撐層。
2
然后將您的樣品懸浮在液體瓊脂糖中，放置在支撐層上
3
將您的樣本（理想情況下呈一條直線）對齊以進(jìn)行成像
4
從側(cè)面去除多余的瓊脂糖以為鏡子留出空間。
U 型玻璃毛細(xì)管
按照《科學(xué)實(shí)驗(yàn)室》文章中描述的協(xié)議進(jìn)行：DLS 樣品準(zhǔn)備：使用 U 型玻璃毛細(xì)管進(jìn)行樣品安裝。
用于固定清理組織的超級膠水
更大的（已透明化的）樣本在直接粘貼到玻璃蓋玻片上時(shí)，可以與樣本架一起使用。
圖5展示了在標(biāo)準(zhǔn)玻璃底培養(yǎng)皿中安裝組織樣本的一種簡單方法。
客戶申請 DLS 準(zhǔn)備
在通過光片顯微鏡掃描的 ECi 透明化腎臟的一部分中，以實(shí)現(xiàn)3D 腎小球的可視化。感謝海德堡大學(xué)曼海姆醫(yī)學(xué)院的Norbert Gretz教授。
參考文獻(xiàn)：
1.Huang J, Brenna C, Khan AUM, Daniele C, Rudolf R, Heuveline V, Gretz N , A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging, Sci Rep. 2019 Jan 24;9(1):521
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