FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)

FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能zui為強(qiáng)大全面的植物顯微熒光研究儀器。它由包含可擴(kuò)展部件的增強(qiáng)顯微鏡、高分辨率CCD相機(jī)、激發(fā)光源組、光譜儀、控溫模塊以及相應(yīng)的控制單元和的工作站與分析軟件組成。它不僅可以進(jìn)行微藻、單個細(xì)胞、單個葉綠甚至基粒-基質(zhì)類囊體片段進(jìn)行Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等各種熒光成像動力學(xué)分析；還能通過激發(fā)光源組進(jìn)行進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測量，從而進(jìn)行GFP、DAPI等熒光蛋白、熒光素以及藻青蛋白、藻紅蛋白、藻膽素等藻類*熒光色素的成像分析；更可以利用光譜儀對各種熒光進(jìn)行光譜分析，區(qū)分各發(fā)色團(tuán)（例如，PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等）并進(jìn)行深入分析。

FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)使熒光成像技術(shù)真正成為光合作用機(jī)理研究的探針，使科研工作者在細(xì)胞和亞細(xì)胞層次深入理解光合作用過程及該過程中發(fā)生的各種變化，為直接研究葉綠體中光合系統(tǒng)的工作機(jī)理提供了zui為有力的工具。

功能特點

·內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素?zé)晒庋芯康娜砍绦?，?/span>Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等，可獲得70余項參數(shù)。

·配備20倍和40倍生物熒光物鏡，可以清晰觀測到葉綠體及其發(fā)出的熒光。

·激發(fā)光源組中包括紅光、藍(lán)光、綠光、白光、紫外光和遠(yuǎn)紅光等，通過紅藍(lán)綠三色光還可以調(diào)出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物體中任何一種色素分子或發(fā)色團(tuán)。

·高靈敏度CCD鏡頭，時間分辨率zui高達(dá)50張每秒，可快速捕捉葉綠素?zé)晒馑沧儭?/span>

·高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖。

·控溫系統(tǒng)可以保證實驗樣品在同等溫度條件下進(jìn)行測量，提高實驗精度，也可以進(jìn)行高溫/低溫脅迫研究。

應(yīng)用領(lǐng)域

·顯微結(jié)構(gòu)的植物光合生理研究

·植物逆境研究

·生物和非生物脅迫的研究

·植物抗脅迫能力及易感性研究

·突變體篩選及光合機(jī)理研究

·藻類長勢與產(chǎn)量評估

·藻類*色素與光合作用關(guān)系

·植物——微生物交互作用研究

·植物——原生動物交互作用研究

·基因工程與分子生物學(xué)研究

 測量樣品

·植物活體切片

·植物表皮

·植物細(xì)胞

·綠藻、藍(lán)藻等各種單細(xì)胞和多細(xì)胞微藻

·葉綠體提取液

·類囊體提取液

·含有葉綠體的原生動物

 工作原理

FKM分析過程中，通過連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內(nèi)置在6位濾波輪中的一系列濾波器、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團(tuán)的動態(tài)熒光。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進(jìn)行熒光光譜分析和熒光動力學(xué)成像分析。SM 9000光譜儀通過光纖與顯微鏡連接，以進(jìn)行激發(fā)熒光光譜分析。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機(jī)則用于熒光動力學(xué)成像分析。全部工作過程通過工作站和控制單元按照預(yù)先設(shè)定好的程序自動進(jìn)行。測量過程中，可通過溫控模塊調(diào)控藻類、植物細(xì)胞等實驗樣品的溫度。蠕動泵可以實現(xiàn)培養(yǎng)藻類的連續(xù)測量。

儀器組成

1.增強(qiáng)顯微鏡

2.高分辨率CCD相機(jī)

3.激發(fā)光源組

4.SM 9000光譜儀

5.主控制單元

6.工作站及軟件

7.控溫模塊的控制單元

8.6位濾波輪

 技術(shù)參數(shù)

·測量參數(shù)

úF₀，F₀’，Fs，Fm，Fm’，Fp，FtDn，FtLn，Fv，NPQ_Dn，NPQ_Ln，Qp_Dn，Qp_Ln，qN，QY，QY_Ln，Rfd等五十多項參數(shù)

úOJIP快速熒光曲線：F₀、F300、Fj、Fi、Fm、Vj、Vi、Fv / Fm、M₀、SM、S_S、N、Phi_P₀、Psi_₀、Phi_E₀、Phi_D₀、Pi_Abs、ABS / RC、TR₀/ RC、ET₀/ RC、DI₀/ RC等

úQA再氧化曲線（選配）

ú熒光光譜圖

·測量光：紅光、藍(lán)光、綠光、白光、紫外光

·光化光：紅光、藍(lán)光、綠光、白光、紫外光，光強(qiáng)為6000-20000μmol(photons)/m2.s（與光質(zhì)和放大倍數(shù)有關(guān)）

·飽和光：紅光、藍(lán)光、綠光、白光、紫外光，光強(qiáng)為13000-80000μmol(photons)/m2.s（與光質(zhì)和放大倍數(shù)有關(guān)）

·透射光：白光、遠(yuǎn)紅光

• 高分辨率CCD：像素可調(diào)，zui高達(dá)1392×1040像素，時間分辨率zui高達(dá)每秒50張

• 顯微鏡：Axio Imager M2

·物鏡：20倍和40倍生物熒光物鏡

·6位濾波輪：葉綠素?zé)晒狻?/span>GFP/SYTOX、DAPI/CTC等

·SM9000光譜儀

ú入射狹縫：70μm×1400μm

ú光柵：平場型校正

ú光譜范圍：200-980nm

ú波長精確度：<0.5nm

ú再現(xiàn)性：<0.1nm

ú溫度漂移：<0.01nm/K

·溫度調(diào)控模塊：溫度調(diào)節(jié)范圍5℃-70℃，精確度0.1℃

·蠕動泵（選配）：流速10-5600μl/min，用于藻類連續(xù)培養(yǎng)測量

• FluorCam葉綠素?zé)晒獬上穹治鲕浖?，?/span>Live（實況測試）、Protocol（實驗程序選擇）、Pre–processing（成像預(yù)處理）、Result（成像分析結(jié)果）等菜單

• Protocol實驗程序可自由編輯，用戶也可利用Protocol菜單中的向?qū)С绦蚰０孀杂蓜?chuàng)建新的實驗程序

• 成像預(yù)處理可以自動選區(qū)或手動選擇不同形狀、不同數(shù)量、不同位置的區(qū)域（Region of interest，ROI），成像分析結(jié)果包括高時間解析度熒光動態(tài)圖、直方圖、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

• 數(shù)據(jù)分析具備“信號計算再平均"模式（算數(shù)平均值）和“信號平均再計算模式"，在高信噪比的情況下選用“信號計算再平均"模式，在低信噪比的情況下選擇“信號平均再計算"模式以過濾掉噪音帶來的誤差

 葉綠素?zé)晒馀c光譜分析結(jié)果

典型應(yīng)用：
1. CLAIRE M. M. GACHON etc. Single-cell chlorophyll fluorescence kinetic microscopy of Pylaiella littoralis (Phaeophyceae) infected by Chytridium polysiphoniae (Chytridiomycota). Eur. J. Phycol., (2006), 41(4): 395–403

2. Hendrik Kupper etc. Reversible coupling of individual phycobiliprotein isoforms during state transitions in the cyanobacterium Trichodesmium analysed by single-cell fluorescence kinetic measurements. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, Volume 1787, Issue 3, March 2009, Pages 155-167

Fig. 1. 吸收光譜與熒光發(fā)射光譜：異構(gòu)藻青蛋白（APC）；藻青蛋白（PC）；藻紅蛋白（PE1、PE2、PE3）；藻尿后膽色素（PUB’s）

Fig.2.各種色素蛋白對F0的貢獻(xiàn)、光譜及其隨時間的變化：異構(gòu)藻青蛋白（APC）；藻青蛋白（PC）；藻紅蛋白（PE1、PE2、PE3）；藻尿后膽色素（PUB’s）

參考文獻(xiàn)：

1.     Ferimazova.et al. (2013): Photosynth Res.: DOI 10.1007/s11120-013-9897-z.

2.     AndresenE. et al. (2009): New Phytologist.

3.     Mijovilovich A. etal. (2009): Plant Physiol. DOI:10.1104/pp.109.144675.

4.     KuepperH. et al. (2009): Plant Physiol.DOI:10.1104/pp.109.139717.

5.     Kuepper H. et al.(2009): BBA 1787: 155-167.

6.     Rocchetta I. and KuepperH. (2009): New Phytologist 182: 405-420.

7.     KuepperH. et al. (2008): New Phytologist 179: 784-798.

8.     KuepperH. et al. (2007): New Phytologist 175: 655-674.

9.     GachonC.M.M. et al. (2006): Eur. J. Phycol. 41: 395-403.

10. SetlikovaE. et al. (2005): Photosynth. Res. 84: 113-120.

11.  Kuepper H. et al. (2004): Plant Physiol. 135: 2120-2133.

12. Ferimazova et al. (2002): Photochem. Photobiol. 76:501-508.

13.  Berman-Frank I. et al. (2001): Science 294: 1534-1537.

14. KuepperH. et al. (2000): Photosynthetica 38: 553/570.