摘要：研究了液相色譜法測(cè)定飼料原料和配合飼料中赭曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)已腈水（84：16）提取，提取液通過赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。對(duì)添加兩個(gè)濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數(shù)RSD分別為0.281%、1.214%，zui低檢測(cè)限為0.20ng/kg，方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確精密度高，值得推廣。

Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in feed .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are satisfactory.

Keywords: HPLC； pretreatment ； ochratoxin A

霉菌遍布世界各地，種類繁多，依生活習(xí)性，分為倉儲(chǔ)霉菌和田間霉菌，前者指儲(chǔ)存原料和飼料在適宜的溫度、濕度下產(chǎn)生的霉菌，zui適宜溫度為25-30℃，相對(duì)濕度80-90%。赭曲霉毒素是溫暖地區(qū)zui重要的倉儲(chǔ)毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長(zhǎng)，據(jù)有關(guān)調(diào)查該毒素污染在原料和配合飼料中普遍存在，陽性率大于60%²。赭曲霉毒素危害很大，致癌性*。據(jù)報(bào)道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見的臨床表現(xiàn)有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對(duì)家畜主要攻擊腎臟、免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，肝臟變得脆弱，劇渴，生長(zhǎng)遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。根據(jù)中國國家有關(guān)規(guī)定，赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.

現(xiàn)常用的檢測(cè)方法多為薄層色譜和酶聯(lián)免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時(shí)長(zhǎng)，而酶聯(lián)免疫法雖操作簡(jiǎn)單，但存在假陽性，準(zhǔn)確性欠佳，此液相色譜法操作簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確靈敏度高，不失為一種好方法。

1.實(shí)驗(yàn)部分：

1.1試劑和儀器

已腈（色譜純）冰醋酸（分析純）去離子水

赭曲霉標(biāo)準(zhǔn)液 PuriTox^SR 130赭曲霉毒素凈化柱液相色譜儀熒光檢測(cè)器

1.2步驟

1.2.1 取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時(shí)取樣量加大，有地方建議取15kg。

1.2.2 提?。喝?/span>25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶?jī)?nèi)，加100ml已腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時(shí)，用定量濾紙過濾。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個(gè)棕色瓶子里吹干，用10ml的流動(dòng)相進(jìn)行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液；另將1 ml10ug/ml

的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內(nèi)吹干，用10ml的流動(dòng)相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 凈化濃縮：取7ml的樣品提取液用PuriTox^SR 130赭曲霉毒素凈化柱，然后將凈化液轉(zhuǎn)移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮?dú)獯蹈桑?/span>400ul的流動(dòng)相（60/40/1水/已腈/已酸）溶解，渦旋30min ，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管內(nèi)10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，轉(zhuǎn)移350ul 的清潔樣品進(jìn)入液相。

1. 3儀器條件

Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測(cè)器

色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm Waters PAHC18（5um）4.6*150mm

流動(dòng)相：60/40 水/已腈

流速：0.5ml/min 運(yùn)行時(shí)間：20min

柱溫：40℃

進(jìn)樣體積：60ul

EX:330nm EM:460nm

2.0測(cè)定結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，上液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)的峰面積對(duì)應(yīng)相應(yīng)濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)為0.9995，回歸方程是Y=1.11×10⁵X-1.85×10³,檢測(cè)限：0.20ng/kg.

表1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本參數(shù)：

Tab.1 Regression equation

濃度范圍 Concn.Range（ng/ml）	1.0	2.0	5.0	10.0	20.0	30.0	50.0
峰面積 Peak area	103454.993	210799.985	515389.964	1064099.926	2285364.840	3442139..760	5463738.891
相關(guān)系數(shù) Correlation	0.9995
回歸方程 Regression equation	Y=1.11×10⁵X-1.85×10³
檢測(cè)限 Limit of detection	0.20ng/kg（按3倍信噪比計(jì)算）

2.2不同濃度添加回收實(shí)驗(yàn)：取玉米樣品1份，分別做兩個(gè)濃度的添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2.兩個(gè)濃度的樣品添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表：

Tab.2 Recovery test

組分 Ingtedient	本底值 Known value （ng/ml）	添加標(biāo)準(zhǔn)液的體積	10ul					35ul
赭曲霉毒素	0	添加處理后理論濃度 Added	14.28ng/ml					50.0ng/ml
		添加次數(shù)	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
		添加后測(cè)得濃度（ng/ml） Found	14.18	14.16	14.13	14.20	14.10	52.06	52.16	51.13	51.68	50.69
		回收率 Recovery （%）	99.30	99.16	98.95	99.44	98.74	104.12	104.32	102.26	103.36	101.38
		平均值 Average value	99.12					103.09
		RSD（%）	0.281					1.214

2.3精密度實(shí)驗(yàn)：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測(cè)定8次，結(jié)果見表3

表3.精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 Precision test

檢測(cè)次數(shù)	1	2	3	4	5	6	7	8	平均值	RSD
樣品1測(cè)定值 Sample 1 Found（ng/ml）	11.23	11.46	11.41	11.36	11.87	11.97	11.67	11.75	11.59	2.27
樣品2測(cè)定值 Sample 2 Found（ng/ml）	28.57	28.62	28.68	28.98	28.87	28.12	28.92	28.53	28.66	0.963

3.0結(jié)論：

真菌毒素檢測(cè)技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)（4）

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