Exosomes分離純化|EXO   

    外泌體（Exosome）發(fā)現于1986年，是一種直徑約30~100nm的雙層膜囊泡狀結構小體，可由機體內多種細胞如免疫細胞、干細胞、心血管細胞、網織紅細胞、血小板、神經細胞和腫瘤細胞等主動分泌產生，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等體液中。

    外泌體（Exosome）攜帶大量特異性的蛋白質（如細胞因子、生長因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質，在體內參與細胞通訊、細胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進程密切相關^[1] [2]。由于外泌體的特殊結構和功能，使得它具有潛在的應用價值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標，另一方面也可以作為治療手段，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療。

    外泌體（Exosome）的分離純化一直是科研工作者關注的問題，獲得高純度的外泌體（Exosome）對后續(xù)的研究至關重要。據了解，目前人們多采用超速離心、免疫磁珠、超濾、沉淀或試劑盒等方法實現外泌體（Exosome）的提取分離：

1、超速離心法（差速離心）

超離法是zui常用的外泌體（Exosome）純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行（如圖所示），可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉子類型有關），純度也受到質疑；此外，重復離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質量^[3]。

2、密度梯度離心

在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體（Exosome）純度較高，但步驟繁瑣，耗時。

3、超濾離心^[4]

由于外泌體（Exosome）是一個大小約幾十納米的囊狀小體，大于一般蛋白質，利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜對樣品進行選擇性分離，便可獲得外泌體。超濾離心法簡單，且不影響外泌體的生物活性，是提取細胞外泌體（Exosome）的一種新方法。

4、磁珠免疫法

外泌體（Exosome）表面有其特異性標記物（如CD63、CD9蛋白）^[5]，用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點，但是效率低，外泌體（Exosome）生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

5、PEG-base沉淀法

聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，早先應用于從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大小不均一，產生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等，因此發(fā)表文章時易受質疑。
    6、試劑盒提取

近幾年來，市場上已出現各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。這些試劑盒不需要特殊設備，隨著產品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。有些試劑盒操作簡便，不用超速離心，同時可獲得高純度和高回收率的外泌體——如101bio開發(fā)的系列試劑盒，可分別針對尿液、血液、細胞上清液等多種樣品進行提取^[6] [7]，并可進一步從外泌體中獲得想要的蛋白質或者RNA分子，方便快速，因而受到大多數人的歡迎，并發(fā)表了不少高質量的文章！

然而，市場上各類產品純化效果良莠不齊，目前仍沒有的方法或試劑盒能滿足所有要求，從各類樣品中分離到理想的外泌體。

參考文獻：

[1] 盧婉, 楊人強, 王伶. 外泌體的研究進展[J]. 生命的化學, 2013, 04期(04).

[2] Taixue An et al. Exosomes serve as tumour markers for personalized diagnostics owing to their important role in cancer metastasis[J]. Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 27522.

- http://dx.doi.org/10.3402/jev.v4.27522.

[3] Richard J. Lobb et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma[J]. Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 27031.

- http://dx.doi.org/10.3402/jev.v4.27031.

[4] 胡國文,李青,牛鑫等. 旋轉超濾：一種提取細胞外泌體的新方法[J]. 第二軍醫(yī)大學學報, 2014, 35(6): 598-602.

[5] Zhang et al. Exosomes in cancer: small particle, big player[J]. Journal of Hematology & Oncology, 2015, 8:83. doi:10.1186/s13045-015-0181-x.

[6] Korbelik M et al. Ceramide and Sphingosine-1-Phosphate/Sphingosine act as Photodynamic Therapy-Elicited Damage-Associated Molecular Patterns: Release from Cells and Impact on Tumor-Associated Macrophages. Janal Bioanal Tech. S1:009. doi: 10.4172/2155-9872.S1-009.

[7]Chen L., Chen R., Brigstock D. MicroRNA profiling of circulating exosomes during experimental liver fibrosis.Hepatology. AASLD abstract, 2014 Oct. (Presidential Honored Distinct Abstract).