在單克隆抗體開發(fā)和生產(chǎn)的許多階段，測定 IgG 的產(chǎn)生是關(guān)鍵步驟。常用的 IgG 定量測定方法要么需要特殊儀器和嫻熟人員，例如高效液相色譜法 (HPLC) 和表面干擾量度法，要么需要耗時的測定法，例如酶聯(lián)免疫吸附檢測 (ELISA)，盡管 ELISA 是一種被廣泛認(rèn)可的蛋白定量方法，但它操作過程時間長，步驟多。而Valitacell公司 的 Valita®TITER通過熒光偏振（FP）檢測實驗，可在細(xì)胞系開發(fā)工作流程中精確快速定量IgG。

 高質(zhì)量藥物開發(fā)篩選高通量IgG定量平臺

基于熒光偏振(FP)技術(shù)Valita®TITER 實驗可以用來檢測 IgG Fc 與蛋白G的相互作用。96 孔微量滴定板的每個孔都涂有熒光標(biāo)記的 IgG 結(jié)合肽蛋白G。向孔中添加樣本時，蛋白G分子重懸并與之發(fā)生結(jié)合。蛋白G結(jié)合抗體時，其分子運動的速度下降，從而導(dǎo)致熒光偏振值升高。

Valita® TITER實驗原理

Valita® TITER實驗流程

如上圖所示，Valita®TITER整個實驗流程無需對樣本做任何處理，無需額外添加任何試劑，更沒有洗板等復(fù)雜操作步驟，僅需不到15分鐘就能完成96個樣的IgG定量，非常的簡單高效！

ValitaCell提供了一個全面優(yōu)化的快速、穩(wěn)健和準(zhǔn)確的IgG檢測平臺，本文我們以Valita®TITER IgG定量試劑盒與Molecular Devices酶標(biāo)儀結(jié)合使用為例。

實驗材料

•  Valitacell Valita®TITER Kit (cat. #VAL003) 或

•  Valitacell Valita®TITER Plus Kit (cat. #VAL004)

•  Sigma IgG standard (Sigma cat. #I2511)

•   XP Media™ CHO Growth A (Molecular Devices cat.

#K8860), supplemented with 4 mM L-glutamine

•  SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader或

•  SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader或

•  SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader或

•  SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader

實驗方法

1.  使用XP Media™ CHO Growth A作為稀釋液，對IgG標(biāo)準(zhǔn)品進行一系列稀釋，稀釋濃度從2.5-100mg/L (Valita®TITER Kit)或100-2000mg/L (Valita®TITER Plus Kit)。

2.  向微孔板中加入60μL培養(yǎng)基。

3.  加入60μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品到相應(yīng)的孔中，吸打3次混勻（實驗過程可參考下圖）。

4.  微孔板常溫避光孵育5分鐘(Valita®TITER Kit)或15分鐘(Valita®TITER Plus Kit)，用Molecular Devices酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置參考下表。

適用于 Valita®TITER Kit 酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置表

適用于 Valita®TITER Plus Kit 酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置表

實驗結(jié)果

研究人員開展的這項工作，主要是為了確定Valita®TITER在Molecular Devices多種型號酶標(biāo)儀上使用時的最佳參數(shù)，以便為高通量藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)提供一個高性價比高通量IgG測定平臺。只需通過簡單的加入-讀板方法制備IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線，沒有樣品前處理、微孔板預(yù)處理、洗板等步驟，實驗流程簡單易操作。

如SpectraMax iD5酶標(biāo)儀使用485 nm激發(fā)光和535 nm發(fā)射光可獲得優(yōu)異的實驗結(jié)果。IgG標(biāo)準(zhǔn)品濃度從2.5mg/L到100mg/L(Valita®TITER)或從100mg/L到2000mg/L (Valita®TITER Plus)在整個范圍內(nèi)具有很好的線性（R² = 0.99）（如下圖）。Valita®TITER Kit 和 Valita®TITER Plus Kit在SpectraMax i3x、Paradigm和 M5平臺的實驗數(shù)據(jù)見下表。SoftMax®Pro軟件中的預(yù)設(shè)置功能可自動進行mP計算和曲線繪制。

Valita®TITER Kit(R²=0.993)標(biāo)準(zhǔn)曲線

Valita®TITER Plus Kit(R²=0.998)標(biāo)準(zhǔn)曲線

 Valita®TITER Kit在Molecular Devices各平臺實驗數(shù)據(jù)

Valita®TITER Plus Kit在Molecular Devices各平臺實驗數(shù)據(jù)

結(jié)論

準(zhǔn)確、可靠地測量IgG濃度以確保生物制劑生產(chǎn)時最佳細(xì)胞培養(yǎng)性能，對藥物開發(fā)和后續(xù)生產(chǎn)至關(guān)重要。一種能夠以最少的時間和資源投入獲得準(zhǔn)確結(jié)果的分析方法是成功的關(guān)鍵。在這里，我們成功地證明了結(jié)合Molecular Devices酶標(biāo)儀和Valita®TITER的測定方法能夠全面的準(zhǔn)確定量IgG濃度。

Valita®TITER分析是一種均相的、高通量的方法，能精確和快速定量IgG濃度，不需要樣品制備或純化步驟。該96孔檢測方法已在SpectraMax iD5酶標(biāo)儀和其他具有FP檢測的Molecular Devices酶標(biāo)儀上充分驗證，以確保結(jié)果可靠。SoftMax Pro軟件能自動進行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和樣本定量，減少檢測的設(shè)置時間。

高質(zhì)量藥物開發(fā)篩選高通量IgG定量平臺

Valita®TITER適用儀器平臺

Valita®TITER兼容市面上常見的多種熒光偏振酶標(biāo)儀，并且由于Valita®TITER的實驗流程非常簡單，該方法不光局限于人工手動操作，還能整合入各種半自動、全自動生產(chǎn)線中，從而實現(xiàn)真正的高通量檢測。

Valita®TITER兼容多種市面常見品牌的讀板儀

Valita®TITER能整合入各種自動化生產(chǎn)線

其他品牌儀器平臺驗證數(shù)據(jù)請聯(lián)系北京西美杰科技有限公司索取。

北京西美杰科技有限公司是ValitaCell品牌的中國區(qū)總代理，如果您對上述產(chǎn)品感興趣，聯(lián)系西美杰獲取更多產(chǎn)品資料和申請測試樣品。