病毒載體技術(shù)的進步提高了基因和細胞治療的安全性和有效性，全球已有多種基因和細胞治療藥物被監(jiān)管機構(gòu)批準上市。目前大多數(shù)基因/細胞治療方法都是利用病毒載體來實現(xiàn)的，其中常用的兩種病毒載體——腺相關(guān)病毒（AAV）載體常被用于基因治療，而慢病毒（LV）載體則常被用于基因修飾的細胞治療。病毒載體通常是將2-4個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293細胞生產(chǎn)出的，而轉(zhuǎn)染試劑是病毒載體生產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一，對轉(zhuǎn)染效率和功能效價有顯著影響。第一代非病毒轉(zhuǎn)染方法依靠簡單的線性聚合物，如聚乙烯亞胺(PEI)或脂質(zhì)體將DNA轉(zhuǎn)入到細胞內(nèi)，但其性能并不能*病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)需求。雖然人工合成轉(zhuǎn)染試劑在過去30年里取得了巨大的進步，但仍然難以逾越大自然在數(shù)十億年進化出的依靠病毒傳遞基因的效率。因此，優(yōu)化非病毒轉(zhuǎn)染性能的最佳方法是盡可能模仿出病毒轉(zhuǎn)運DNA的自然機制的試劑。

TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染試劑

西美杰代理的Mirus轉(zhuǎn)染試劑就是利用自然基因傳遞機制作為其化合物庫的設(shè)計靈感，從中篩選出適合病毒生產(chǎn)的混合配方，將轉(zhuǎn)染試劑與核酸的靜電相互作用、細胞吸附與內(nèi)吞、胞內(nèi)釋放、基因表達效率和降低細胞毒性等幾乎所有影響轉(zhuǎn)染成功率的因素全部考慮在內(nèi)。通過不懈的努力，Mirus開發(fā)出了一種全新的仿生轉(zhuǎn)染技術(shù)——TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染試劑，它不僅僅是基于PEI或脂質(zhì)體，而是采用多組分脂質(zhì)聚合物納米復(fù)合物（LPNC），能夠高效地結(jié)合和包裹DNA，將其帶入懸浮或貼壁的HEK293細胞中，然后將其從細胞核內(nèi)釋放，以便同時滿足2-4個不同的質(zhì)粒的表達，這種全新的轉(zhuǎn)染試劑比單獨使用PEI及其衍生聚合物或脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率和完整病毒生產(chǎn)效率都有顯著提高。同時，Mirus還研發(fā)出了一種*合成的（無動物源）轉(zhuǎn)染增強劑（Enhancer），與TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑搭配使用時，可以進一步提高病毒滴度。另外，為了滿足病毒載體從研發(fā)到大規(guī)模生產(chǎn)不同階段的需求，Mirus分別推出了R&D、SELECT和GMP三種級別的TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染系列產(chǎn)品，以適應(yīng)不同階段病毒載體的生產(chǎn)規(guī)模、效率以及法規(guī)要求。

實驗表明，Mirus基于LPNC的轉(zhuǎn)染試劑可以在不同的細胞培養(yǎng)平臺（貼壁和懸?。?/span>、生物反應(yīng)器和培養(yǎng)基類型中提高病毒產(chǎn)量和功能性病毒滴度。與業(yè)內(nèi)其他金標準相比，在不使用增強劑的情況下，病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增強劑之后，在合適的培養(yǎng)條件下，病毒產(chǎn)量甚至能夠提高10倍以上！（結(jié)果見下圖1-5）

圖1. 基于脂質(zhì)聚合物納米復(fù)合物（LPNC）和聚乙烯亞胺（PEI）配方的轉(zhuǎn)染試劑用于腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(LV)載體生產(chǎn)的性能對比。分別用基于LNPC的TransIT-VirusGEN試劑（不含增強劑與含增強劑）、25kda PEI和基于PEI技術(shù)的競爭品牌A3轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)生AAV（左）和LV（右）。以LPNC為基礎(chǔ)的TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑比以PEI為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染試劑的病毒顆粒表達量高3-5倍。當(dāng)TransIT-VirusGEN和增強劑同時使用時，比單獨使用TransIT-VirusGEN大約提升了一倍。轉(zhuǎn)染試劑 : DNA的比值為體積 : 質(zhì)量。

圖2. TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑在不同細胞培養(yǎng)基中的表現(xiàn)。使用Thermo Fisher Scientific公司的病毒生產(chǎn)細胞進行轉(zhuǎn)染，該細胞適應(yīng)四種不同的培養(yǎng)基配方，分別來自Thermo Fisher公司的LV-MAX培養(yǎng)基、Expi293表達培養(yǎng)基、FreeStyle F17表達培養(yǎng)基和來自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培養(yǎng)基。后一種培養(yǎng)基的AAV總效價較高，但在所有使用的培養(yǎng)基中，無論是否添加增強劑，TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑均表現(xiàn)優(yōu)異。DNA與轉(zhuǎn)染試劑配比為2μg DNA ：3μl轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染細胞密度為2.0×106個/ml。生產(chǎn)LV也獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖3. 分別在四種不同的轉(zhuǎn)染條件和兩個不同的收獲時間，測定TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑和PEI為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染試劑A3的物理滴度和功能滴度。利用Expi293F細胞生產(chǎn)AAV2-GFP。轉(zhuǎn)染48小時和72小時后收獲的病毒分別測定功能滴度TU/mL（左）和物理滴度GC/mL（右）。結(jié)果顯示用TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑和增強劑轉(zhuǎn)染收獲的病毒效價最高。此外，TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑比PEI為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染試劑的表達更快。這些結(jié)果表明，對于病毒滴度的評估，功能滴度可能是一個更可靠的指標。因此，建議測試幾個不同的收獲時間點來確定最佳方案。

圖4. 每種培養(yǎng)體系都應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染時的細胞融合度和接種密度。用DMSO+10%胎牛血清培養(yǎng)貼壁的HEK293t/17細胞生產(chǎn)慢病毒（1μg DNA/mL）。試劑盒包括TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑、VirusGEN LV復(fù)合物形成溶液和VirusGEN LV增強劑。

圖5. 在Expi293表達培養(yǎng)基中培養(yǎng)Expi293F細胞，使用VirusGEN AAV轉(zhuǎn)染試劑盒，內(nèi)含TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑、VirusGEN AAV復(fù)合物形成溶液和VirusGEN AAV增強劑，在懸浮細胞培養(yǎng)中生產(chǎn)AAV。分別用2:1（左）和3:1（右）兩種比例來確定理想的轉(zhuǎn)染試劑和DNA配比（體積：質(zhì)量）。每種轉(zhuǎn)染體系都應(yīng)對轉(zhuǎn)染試劑: DNA配比及每毫升細胞所需的總DNA量進行優(yōu)化。

TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染產(chǎn)品信息

TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染試劑

美國Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開發(fā)高效、低毒轉(zhuǎn)染試劑的公司之一，同時也是目前該類試劑主要的供應(yīng)商之一。Mirus許多杰出成果獲得廣大用戶的好評。

北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)代理，始終秉承著專業(yè)、嚴謹?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。如果您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎聯(lián)系北京西美杰解更多產(chǎn)品信息或申請試用。北京西美杰是Mirus代理，Mirus中國代理，Mirus北京代理，Mirus總代理，Mirus上海代理，，Mirus西北代理，Mirus西南代理，Mirus東北代理，Mirus華北代理，Mirus華南代理，Mirus華中代理，負責(zé)Mirus在中國的相關(guān)業(yè)務(wù)。

引用文獻：

Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.