免疫組織化學(xué)抗原修復(fù)

 由于石蠟切片標(biāo)本多數(shù)使用甲醛固定，甲醛在組織中所形成的醛鍵、羧甲基等封閉了部分抗原決定簇，或由于蛋白分子之間的交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。因此在染色前有些抗原需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露才能使組織中的抗原抗體充分結(jié)合，出現(xiàn)理想的染色結(jié)果。至于哪種抗原需要進(jìn)行修復(fù)。需在建立染色程序時(shí)確定。常用的方法有加熱抗原修復(fù)法和酶消化法兩種。經(jīng)大量試驗(yàn)驗(yàn)證．加熱抗原修復(fù)法優(yōu)于酶消化法，其機(jī)制目前仍不清楚，可能是加熱打開(kāi)了組織抗原因甲醛固定所引起的抗原決定簇的交聯(lián)，因此使免疫組織化學(xué)染色的敏感度大幅度提高。

    (1)加熱修復(fù)法：加熱修復(fù)法分為高壓加熱修復(fù)法和微波修復(fù)法兩種：

    ①高壓加熱修復(fù)法：取一定量枸櫞酸鹽緩沖液(pH＝6．0)于高壓鍋中，大火加熱直至沸騰。將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放人己沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋，扣緊壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽。從噴汽開(kāi)始計(jì)時(shí)．1～2分鐘后，高壓鍋離開(kāi)熱源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來(lái)水籠頭下加速冷卻)，取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，再用PBS沖洗2次，每次3分鐘。注意加熱時(shí)間長(zhǎng)短的控制很重要，從組織切片放人緩沖液到高壓鍋離開(kāi)火源的總時(shí)間控制在5―8分鐘為好．時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)使染色背景加深。緩沖液的量必須保證能浸泡到所有切片，用過(guò)的枸櫞酸緩沖液不能反復(fù)使用。

    ②微波修復(fù)法：取一定量pH 6．0枸櫞酸鹽緩沖液(緩沖液量不得小于500m1)，于微波盒中，微波加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上。放人己沸騰的緩沖液中，中微波繼續(xù)處理15―20分鐘，取出微波盒冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片。先用蒸餾水沖洗2次，之后用PBS沖洗2次，每次3分鐘。

    (2)胰蛋白酶消化修復(fù)法：主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。使用0．1％氯化鈣液(pH7．8)制成0．1％胰蛋白酶液，37℃孵育切片15～30分鐘，之后用PBS洗滌3次，每次3分鐘。

    (3)胃蛋白酶消化修復(fù)方法：主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。一般使用濃度為0.4％，消化時(shí)間為37℃，30～180分鐘。