脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理和步驟詳解

1、細(xì)胞傳代

1）棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

2）用移液槍加入1ml胰酶，消化1min（37℃，5% CO2）。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞*從壁上脫落下來為止。

3）加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

4）用移液槍多次吹吸，使細(xì)胞*分散開。

5）將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

6）用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后選擇0.8 x 106個細(xì)胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。

7）將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

8）將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

A、將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10s，溶解脂狀物。

B、震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩。

2）選擇合適的混合比例（1:1-1:2/脂質(zhì)體體積ul：DNA質(zhì)量ug）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

3）將混合液在室溫放置10-15min。

4）吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

5）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

6）到時間后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。

3、第二次細(xì)胞傳代

1）在轉(zhuǎn)染后24h，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

2）再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8 x 105個細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新分入培養(yǎng)皿中。

3）在正常條件下培養(yǎng)24h后，按照染色要求條件固定。