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初級(jí)會(huì)員 | 第10年

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Western Blot 蛋白印跡法 --詳細(xì)中文操作指南(新手適用)

時(shí)間:2009/8/2閱讀:2702
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Western Blot 蛋白印跡法 --詳細(xì)中文操作指南(新手適用)

 

Western Blot 蛋白印跡法 --詳細(xì)中文操作指南(新手適用)

 

這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體,并以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測(cè)之。Western使用的探針是抗體,它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。

 

儀器:高壓鍋、玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、分光光度儀、—20℃低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床。

試劑:?jiǎn)稳ノ蹌┝呀庖骸?span lang="EN-US">0.01mol/L PBS (pH7.3)、10%分離膠、4%濃縮校、G250考馬斯亮藍(lán)溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X5XSDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10X麗春紅染液、封閉液、TBSTTBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、定影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑。

雜品與耗材:各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器;各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材;硝酸纖維素膜,乳膠手套,保鮮膜,搪瓷盤(>20×20cm),X-光片夾,X-光片,玻棒長(zhǎng)短各一根,計(jì)時(shí)器,吸水紙,

 

試劑配制:

(一)母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris (MW121.14) 30.29g

蒸餾水           200ml

溶解后,用濃鹽酸調(diào)pH至所需點(diǎn)(見(jiàn)下所示),zui后用蒸餾水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。

PH                     HCl

7.4                    17ml

7.5                    16m

7.6                    15ml

8.0                    10ml

 

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF

PMSF         0.174g

異丙醇       100ml

溶解后,分裝于1.5ml離心管中,-20℃保存。

 

0.2mol/L NaH2PO4

NaH2PO4MW119.98    12g

蒸餾水            500ml

溶解后,高壓滅菌,室溫保存。

 

0.2mol/LNa2HPO4

Na2HPO4·12H2OMW 358.14  71.6g

蒸餾水              1000ml

溶解后,高壓滅菌,室溫保存。

 

10SDS


 

SDS       10g

蒸餾水    100ml

50℃水浴下溶解,室溫保存。如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀,水浴溶化后,仍可使用。

 

10%過(guò)硫酸胺(AP

過(guò)硫酸胺   0.1g

超純水    1.0ml

溶解后,4℃保存,保存時(shí)間為1周。

 

1.5mol/L Tris·HClpH8.8

Tris (MW121.14)   45.43g

超純水            200ml

溶解后,用濃鹽酸調(diào)pH8.8,zui后用超純水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。

 

0.5mol/L Tris·HClpH6.8

Tris (MW121.14)  15.14g

超純水            200ml

溶解后,用濃鹽酸調(diào)pH6.8,zui后用超純水定容至250ml,高溫滅菌后室溫

 

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