Western Blot 蛋白印跡法 --詳細中文操作指南（新手適用）

Western Blot 蛋白印跡法 --詳細中文操作指南（新手適用）

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這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對非放射性標記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。

儀器：高壓鍋、玻璃勻漿器、高速離心機、分光光度儀、—20℃低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床。

試劑：單去污劑裂解液、0.01mol/L PBS （pH7.3）、10％分離膠、4％濃縮校、G250考馬斯亮藍溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10X麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、定影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑。

雜品與耗材：各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器；各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纖維素膜，乳膠手套，保鮮膜，搪瓷盤（>20×20cm），X-光片夾，X-光片，玻棒長短各一根，計時器，吸水紙，

試劑配制：

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris （MW121.14） 30.29g

蒸餾水           200ml

溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點（見下所示），zui后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。

PH                     HCl

7.4                    約17ml

7.5                    約16m

7.6                    約15ml

8.0                    約10ml

1.74mg/ml （10mmol/L）PMSF

PMSF         0.174g

異丙醇       100ml

溶解后，分裝于1.5ml離心管中，－20℃保存。

0.2mol/L NaH₂PO₄

NaH₂PO₄（MW119.98）    12g

蒸餾水            至 500ml

溶解后，高壓滅菌，室溫保存。

0.2mol/LNa₂HPO₄

Na₂HPO₄·12H2O（MW 358.14）  71.6g

蒸餾水              至1000ml

溶解后，高壓滅菌，室溫保存。

10％SDS

SDS       10g

蒸餾水    至100ml

50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％過硫酸胺（AP）

過硫酸胺   0.1g

超純水    1.0ml

溶解后，4℃保存，保存時間為1周。

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）

Tris （MW121.14）   45.43g

超純水            200ml

溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，zui后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）

Tris （MW121.14）  15.14g

超純水            200ml

溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，zui后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫

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