臨床免疫測定技術(shù)發(fā)展的歷史

臨床免疫測定技術(shù)發(fā)展的歷史

    *，現(xiàn)代免疫學的發(fā)展與微生物學尤其是細菌學是密不可分的，臨床免疫測定技術(shù)的發(fā)展亦是如此。當機體感染病原微生物時，要想使臨床醫(yī)師盡早采取適當?shù)拇胧┻M行治療，人們就希望能盡快盡早地知道機體所感染的是何種病原體，傳統(tǒng)的病原體感染診斷一般要經(jīng)過這樣一個過程，即首先對可能存在有病原體的體液或分泌物標本進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)后，再通過分析其形態(tài)學、生物學和生物化學特性，以確定其到底是哪一類及哪一種病原體。這是一種行之有效的方法，直至今天，其仍是病原體感染診斷難以替代的“金標準”，但是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法診斷病原體感染，不但繁瑣、費時以及效率低，而且并不是的，因為有一些病原體，或采用體外培養(yǎng)方法生長特別緩慢，或根本就沒有合適的培養(yǎng)方法，這就使得這一類病原體感染的診斷難以進行。比如，沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis）作為一種細胞內(nèi)專性寄生病原體，使用體外培養(yǎng)方法檢測，不但時間特別長，而且很容易培養(yǎng)失敗，得到假陰性結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)亦是如此。又如，有些病毒如大家熟知的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)合適的可用于臨床診斷的培養(yǎng)方法。因此，這些難于采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測的病原體感染診斷治療的要求，迫使人們必須去尋找其他的檢測途徑，直接的或是間接的。此外，即使是可以用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的病原體，僅進行形態(tài)及生物化學鑒定，有時并不足以*準確地鑒定病原體，仍具有一定程度的盲目性。于是，隨著人們對病原體感染與機體免疫應(yīng)答的逐步認識，以抗原抗體特異反應(yīng)為基礎(chǔ)的，更為快速簡便的免疫檢驗方法就應(yīng)運而生了?？偟膩碚f，檢測病原體感染的免疫檢驗方法根據(jù)其檢測目的物可分為兩類，一類是檢測病原體抗原而直接反映病原體感染的方法，另一類是檢測機體因?qū)Σ≡w的抗體應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體而間接反映病原體感染的方法。

    臨床免疫檢驗技術(shù)的出現(xiàn)zui早可追溯至19世紀末。1896年，Widal發(fā)現(xiàn)在傷寒桿菌中加入傷寒病菌人的血清可致傷寒桿菌發(fā)生特異的凝集現(xiàn)象，利用這種凝集現(xiàn)象可有效的診斷傷寒病，這就是zui早的用于病原體感染診斷的免疫凝集試驗，亦即的肥達試驗（Widaltest）。稍后，即1897年，Kraus又發(fā)現(xiàn)將細菌培養(yǎng)液與其相應(yīng)的抗血清混合后可發(fā)生肉眼可見的沉淀反應(yīng)，于是，免疫沉淀試驗又應(yīng)運而生。到1900年，維也納大學病理解剖系的年僅32歲的助教Landsteiner發(fā)現(xiàn)在一些人的血漿能使另一些的紅細胞凝集，這種同種凝集現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，成為人類血型分類的基礎(chǔ)，并由此而衍生了生物科學中的一個特殊分支即免疫血液學，Land—steiner也因人類血型的發(fā)現(xiàn)獲得了1930年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。并且，直至今天，我們?nèi)匀辉谑褂没镜募t細胞凝集試驗鑒定ABO血型。在同一年代，Bordet又發(fā)現(xiàn)了補體結(jié)合試驗（c。mplementfixationtest，CFT），即抗原抗體反應(yīng)后具有補體結(jié)合的能力，如紅細胞與溶血素反應(yīng)后，如有補體存在即可出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。因此，利用這種免疫溶血機制做指示系統(tǒng)，可以檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的存在與否。1906年Wassermann將這種試驗用于梅毒螺旋體感染的診斷，建立了的華氏反應(yīng)。

    下面我們首先來看看免疫沉淀反應(yīng)測定技術(shù)的發(fā)展歷程。1902年Ascoli建立了環(huán)狀沉淀試驗。1905年Bechhold將抗體混溶在明膠中，然后再將相應(yīng)特異抗原加于其上，抗原抗體的特異結(jié)合可在明膠中出現(xiàn)沉淀。1946年Oudin報道了試管單向免疫擴散試驗。到1965年Mancini又提出了平板單向免疫擴散試驗，這種試驗的出現(xiàn)使得以前只能進行定性測定的免疫試驗進入到了定量的時代，并且其仍是目前zui為常用的簡易抗原定量方法，如免疫球蛋白、補體C3和C4等的測定。由Ouchterlony首先報道的平板法雙向免疫擴散試驗，仍然是抗原抗體鑒定的zui基本方法之一。由Grabar和Williams在內(nèi)1953年首先報道的免疫電泳，其將區(qū)帶電泳和免疫雙擴散有機地結(jié)合了起來，可很方便地用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異體液蛋白的識別。其后，又出現(xiàn)了對流免疫電泳、火箭免疫電泳和免疫固定電泳（im—munolixationelectrophoresis，IFE）等。免疫沉淀反應(yīng)發(fā)展到此，基本上可以說是經(jīng)典免疫沉淀試驗發(fā)展階段，這些所謂的經(jīng)典免疫沉淀試驗不但測定范圍狹窄（10～lOOt~g／m1）、靈敏度低，而且繁瑣費時，不能自動化，因此，到了20世紀70年代，根據(jù)抗原抗體能在液相中快速結(jié)合的原理，出現(xiàn)了微量免疫沉淀試驗，即免疫透射比濁測定、免疫膠乳比濁測定和免疫散射比濁測定，這幾種比濁測定方法均已用于臨床體液特定蛋白含量的測定，現(xiàn)已有多種自動化檢測儀器應(yīng)用于臨床檢驗，尤其是免疫散射比濁測定。

    免疫凝集反應(yīng)測定技術(shù)則經(jīng)歷了直接凝集試驗、間接凝集試驗和自身紅細胞凝集試驗等幾個發(fā)展階段。直接凝集試驗常用的有玻片法和試管法兩種，如在玻片上進行的紅細胞ABO血型的鑒定試驗，在試管中進行的肥達試驗和外斐試驗（Weil-Felixtest）以及交叉配血凝集試驗等。間接凝集試驗中曾經(jīng)應(yīng)用較為廣泛的有間接血凝試驗和膠乳凝集試驗，如國內(nèi)20世紀80年代初廣為應(yīng)用于HBsAg測定的反向間接血細胞凝集試驗，用于hCG和類風濕因子（RF）測定的膠乳凝集試驗等。自身紅細胞凝集試驗則是近些年來發(fā)展的不同于以前的免疫凝集試驗的快速檢驗技術(shù)，其zui大的特點是采用一種雙功能抗體試劑，以患者自身紅細胞作為凝集反應(yīng)指示系統(tǒng)，檢測方便快速，只要2min就完成凝集反應(yīng)。

    由上述可見，以免疫沉淀和免疫凝集反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫檢驗技術(shù)，除了免疫比濁外，均無需特殊的儀器設(shè)備，操作簡單方便，有些具體測定方法，即使是在今天，仍有著廣闊的應(yīng)用空間，有其不可替代的一面，盡管如此，以免疫沉淀和免疫凝集反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫檢驗技術(shù)的局限性還是非常明顯的，如測定靈敏度低，除少數(shù)外，基本上都是定性測定等，這些缺陷大大限制了其在病原體感染診斷及體液中微量生物活性物質(zhì)測定中的應(yīng)用價值。

    如果我們將免疫沉淀和免疫凝集試驗定為經(jīng)典的免疫測定技術(shù)，那么，標記免疫測定技術(shù)就可以說是現(xiàn)代免疫測定技術(shù)，經(jīng)典的免疫測定技術(shù)所不能解決的臨床測定問題在標記免疫測定技術(shù)前均能迎刃而解。在標記免疫測定技術(shù)中zui早使用的標記物是熒光素。1941年Coons建立的熒光素標記抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）為定位組織和細胞中的抗原物質(zhì)提供了‘個直接而又有效的手段。在20世紀40年代以前，所出現(xiàn)免疫測定技術(shù)基本上都是定性或半定量測定方法，到50年代末60年代初，才出現(xiàn)*的定量測定方法，即放射免疫試驗（radioimmnuoassay，RIA）。高靈敏放免測定技術(shù)的出現(xiàn)，解決了以前難以測定的微量生物活性物質(zhì)如激素的臨床檢測問題，其之一Yalow因此而獲得了1977年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。盡管放免測定技術(shù)的出現(xiàn)是免疫測定技術(shù)發(fā)展*的一個里程碑，但由于其有試劑半衰期短，實驗廢液難以處理，污染環(huán)境等缺點，使得其現(xiàn)已在逐步退出在臨床常規(guī)檢驗中的應(yīng)用，而采用非放射性核素標記物建立標記免疫測定技術(shù)成為發(fā)展主流。1966年，美國的Nakane和Pierce以及法國的Avrameas和Uriel同時報道了酶免疫測定技術(shù)。其將酶替代熒光素，用于抗原在組織中的定位，可通過光學顯微鏡和電子顯微鏡來觀察。60年代末，在酶免疫組織化學的基礎(chǔ)上，Engvall和Perlmann以及Van Weeman和Schuurs等發(fā)展了一種酶標固相免疫測定技術(shù)，即酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent as—say，ELISA），這種簡單方便的免疫測定技術(shù)出現(xiàn)后，不但成為了一種非常簡便的研究工具，而且迅速地應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)及標志物的臨床檢測，并在臨床應(yīng)用中逐步取代了放免技術(shù)。其后，1972年Rubenstein等又建立了一種無需分離洗滌步驟的均相（homogeneous）酶免疫測定技術(shù)——酶放大免疫分析技術(shù)（Enzyme multiplied immunoassay technique，E—MIT），這種測定技術(shù)主要限于小分子物質(zhì)如藥物等的測定應(yīng)用。隨著70年代中期雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了單克隆抗體，其應(yīng)用于免疫測定，極大地提高了免疫測定的靈敏度和特異性，且為各種免疫測定方法的設(shè)計提供了廣闊的想象空間，各種免疫測定技術(shù)相繼出現(xiàn)，如一步法雙抗體夾心酶免疫測定，各種均相酶標或放射性核素標免疫測定方法等。到了80年代，研究人員又發(fā)現(xiàn)膠體金可以作為抗體的標記物，建立簡便快速的免疫滲濾層析試驗，即所謂的金標試紙條。進入90年代，使用不同測定原理的各種自動化免疫分析儀不斷應(yīng)用于臨床檢驗，給我們實驗室的日常工作不但帶來了很大的便利，而且其測定較之人工操作更為穩(wěn)定和準確。近幾年，基因工程免疫測定試劑和基因工程抗體的發(fā)展，又一次拓寬了免疫測定技術(shù)的發(fā)展途徑。

    綜觀免疫測定技術(shù)100多年的發(fā)展歷程，可以看出，這種建立在抗原抗體特異相互作用基礎(chǔ)上的臨床檢驗技術(shù)，已成為我們認識了解生命未知物質(zhì)的一個難以替代的手段，其發(fā)展的每一步都來自于相關(guān)學科研究認識的深入。如果說抗原抗體特異相互作用只是免疫測定技術(shù)的基本框架，那么，標記物、單克隆抗體、固相支持物等等就像是這個框架上zui豐富多彩的外裝。

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