常用培養(yǎng)基的選擇、制備、滅菌與消毒

 

不同基因型可能需要不同的基本培養(yǎng)基，但同一種植物在培養(yǎng)的不同階段或適用于不同的培養(yǎng)目的時，所需基本培養(yǎng)基也不同。通常按培養(yǎng)階段和目的可劃分為啟動或誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基等多種，這種劃分可能僅僅是激素的調(diào)整，或同一基本培養(yǎng)基某些成分的改變，甚至基本培養(yǎng)基種類的不同。如大多數(shù)植物在生根培養(yǎng)時使用1/2~1/4 MS或其他低鹽培養(yǎng)基如White培養(yǎng)基，體細(xì)胞胚胎發(fā)生也經(jīng)常在不同階段要改變氮源的類型和比例等。基本培養(yǎng)基種類也可能影響到生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用效果，因此需要考慮不同基本培養(yǎng)基與不同濃度的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)之間的互作。

 

通常在對一種植物進(jìn)行組織培養(yǎng)前，首先應(yīng)查尋同屬、同種或同品種植物組織培養(yǎng)的有關(guān)資料，參考前人的研究成果。無法查找到有關(guān)資料，可以一些的基本培養(yǎng)基如MS、WPM或B5等開始試驗。如果對現(xiàn)有的基本培養(yǎng)基的篩選效果不理想，可以以MS、WPM或B5等基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行改良，改良的方法一般有以下幾種：

 

（1）將基本培養(yǎng)基的大量成分或無機(jī)鹽成分減半至減四分之三（1/2，1/3，2/3，1/4，或3/4），或不同基本培養(yǎng)基成分組合如將B5的無機(jī)鹽成分與MS的有機(jī)成分組合在一起等；

（2）增減氮源水平及調(diào)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮（銨鹽和硝酸鹽）的種類和比例，氮源通常對培養(yǎng)物的質(zhì)量和發(fā)育路線影響較大；

（3）增加鈣鹽，以改善木本植物培養(yǎng)中的鈣缺乏；

（4）附加多種維生素、氨基酸及有機(jī)添加物，這對營養(yǎng)需求復(fù)雜或難培養(yǎng)的植物較為有效；

（5）對植物生長土壤及體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行測定，給基本培養(yǎng)基改良提供參考；

（6）將無機(jī)鹽、有機(jī)成分及生長素和細(xì)胞分裂素劃分為高、中、低三個水平，進(jìn)行81（34）種組合試驗，這樣更為。總之，可通過培養(yǎng)基質(zhì)量（成分）和數(shù)量（濃度）調(diào)整，優(yōu)化和選擇與既定植物材料的特定要求相適合的基本培養(yǎng)培養(yǎng)基。

 

植物組織培養(yǎng)基中經(jīng)常改變的因子是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，尤其是生長素和細(xì)胞分裂素。生長素和細(xì)胞分裂素的種類、數(shù)量和比例通常根據(jù)經(jīng)驗或激素的性質(zhì)與功能確定。但更科學(xué)的方法是采用單因子試驗法和多因子試驗法（正交設(shè)計），這樣可以采用生物統(tǒng)計學(xué)方法對結(jié)果進(jìn)行分析。如以一種基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將生長素（如NAA）和細(xì)胞分裂素（如BA）各以 9種濃度水平（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/l）組合成81種處理，可以得到好的生長素和細(xì)胞分裂素濃度水平的組合。正交設(shè)計雖然科學(xué)合理，考慮到了兩類激素之間的互作，但工作量較大。

 

實踐中也可以采用固定生長素濃度，改變細(xì)胞分裂素種類或濃度，選擇優(yōu)的細(xì)胞分裂素種類和濃度；以及反過采用同樣的方法也可對生長素進(jìn)行選擇?；蛘哂袝r為減少工作量，可代表性地配制數(shù)量較少的幾種組合（如生長素濃度相對高的一種，細(xì)胞分裂素濃度高的一種，生長素和細(xì)胞分裂素相平衡的一種），首先確定那類較為適合，然后根據(jù)適合的一類，利用單因子或多因子試驗法進(jìn)一步確定適激素組合。確定適光照和溫度等因子的方法也同此。

 

制備、滅菌與消毒：

一、實驗?zāi)康?nbsp;

了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。 

 

二、實驗原理 

培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。 

 

牛肉gao蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用廣泛和普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長繁殖所需要的基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長繁殖之用。 

 

干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。 

 

三、試劑與器材 

1.器材 

試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。 

 

2.試劑 牛肉gao、蛋白胨、NaCl、瓊脂 

 

四、實驗內(nèi)容 

1.稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查 

2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物 

3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查 

4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌 

 

五、關(guān)鍵步驟及注意事項 

1.要嚴(yán)格按配方配制。 

2.調(diào)pH不要過頭。 

3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70ºC以下放物、取物。 

4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。 

5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當(dāng)，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。