深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第16年

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VEGF ELISA試劑盒

時(shí)間:2011/11/12閱讀:1304
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VEGF ELISA試劑盒
日本IBL*,貨號(hào):27171
日本IBL中國(guó)*代理商“深圳科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司”竭誠(chéng)為您服務(wù)
前言說(shuō)明
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種同型二聚體蛋白,zui初人們是從富含正常牛垂體濾泡星形蛋白細(xì)胞的基質(zhì)中分離純化得到,由各種血管組織分泌。后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)VEGF與一種血管通透因子(VPF)相同, VPF是之前在富含腫瘤細(xì)胞系的基質(zhì)中鑒別得到的,腫瘤細(xì)胞可以提高毛細(xì)血管的通透性。據(jù)報(bào)道,VEGF的活性包括促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)血管的生成和提高毛細(xì)血管的通透性。VEGF是一種分子量為38.2kDa的同型二聚體,它由兩條含165個(gè)氨基酸的多肽鏈組成。多數(shù)人腫瘤細(xì)胞都會(huì)分泌VEGF,包括:人肺腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、纖維肉瘤、HL60早幼粒細(xì)胞性白血病、GS-9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤和U937淋巴瘤細(xì)胞。一些正常的組織也會(huì)分泌VEGF,如:活化的巨噬細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞、支氣管及脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞,腎小球內(nèi)臟上皮及其系膜細(xì)胞。IBL公司的人VEGF ELISA試劑盒可用于人EDTA血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的定量檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)原理
此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒,使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑,zui終溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中VEGF的量成正比。
測(cè)定范圍
15.63~1000pg/ml (*次溫育:37℃下溫育60min)
7.81~500pg/ml (*次溫育:4℃下溫育過(guò)夜)
預(yù)期用途
此試劑盒可用于人EDTA血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液上清EGF的體外定量檢測(cè)。此試劑可識(shí)別天然的和重組的VEGF。利用夾心法的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),采用用了高特異性的多克隆抗體和單克隆抗體。
試劑盒成分
1)  包被板:微孔中包被了抗人VEGF-1(16F1)的鼠IgG單克隆抗體,96孔。
2)  濃縮型酶標(biāo)抗體:HRP標(biāo)記的抗人VEGF-1兔IgG Fab片段,30倍濃縮,0.4ml
3)  標(biāo)準(zhǔn)品:內(nèi)含重組的人VEGF 165,0.5ml×2
4)  EIA緩沖液:1%的BSA,含0.05%的吐溫的PBS,30ml
5)  酶標(biāo)抗體稀釋液:內(nèi)含的1%BSA、0.05%吐溫20的PBS,12ml
6)  顯色劑:TMB底物液,15ml
7)  終止液:1N的H2SO4,12ml
8)  濃縮洗滌液:內(nèi)含0.05%吐溫的磷酸緩沖液(40倍濃縮),50ml。
實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供


 

l         酶標(biāo)儀(450nm)
l         帶刻度的量筒與燒杯
l         孵箱(37℃±1℃)
l         吸水紙
l         冰箱(4℃)
l         試管
l         微量移液器和取樣吸頭
l         去離子水
l         坐標(biāo)紙(log/log)
l         用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管
l         洗滌瓶


 

試劑準(zhǔn)備
1.       洗滌緩沖液制備:先將洗滌濃縮液平衡至室溫,充分混勻,然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻,即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi),并于2周內(nèi)使用
2.       標(biāo)記抗體的制備:用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍,即得。
例:如果只測(cè)一條板,8孔,則需要標(biāo)記抗體800ul(30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液,混勻,使用時(shí)每孔加100ul)
此步驟在實(shí)驗(yàn)前完成
剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶?jī)?nèi),保存在4℃
3.       標(biāo)準(zhǔn)品的制備:吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶?jī)?nèi),充分混勻,得到2000pg/ml的人VEGF標(biāo)準(zhǔn)品
4.       標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:準(zhǔn)備8個(gè)試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋,每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號(hào)管                 1000pg/ml
2號(hào)管                 500pg/ml
3號(hào)管                 250pg/ml
4號(hào)管                 125pg/ml
5號(hào)管                62.5pg/ml
6號(hào)管                 31.25pg/ml
7號(hào)管                15.63pg/ml
8號(hào)管                 0pg/ml(試驗(yàn)樣品空白)
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號(hào)管混勻,然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管,依次連續(xù)稀釋,標(biāo)準(zhǔn)品范圍為1000~15.63pg/ml
 
5.       樣品稀釋:樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒(méi)有估計(jì),我們建議,先用幾個(gè)不同稀釋比例的樣品進(jìn)行檢測(cè),來(lái)確定樣品的*稀釋比例
實(shí)驗(yàn)步驟
使用前,所有樣品應(yīng)平衡至室溫,大約30min,然后充分混勻,確保試劑質(zhì)量無(wú)變化,標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行

試劑
檢測(cè)樣品
標(biāo)準(zhǔn)品
檢測(cè)樣品對(duì)照孔
試劑對(duì)照孔
檢測(cè)樣品100ul
稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(1-7管)100ul
EIA緩沖液(第8管) 100ul
EIA緩沖液100ul
蓋板,37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜
洗板7次
酶標(biāo)抗體
100ul
100ul
100ul
-
蓋板,4℃下溫育30min
洗板9次
顯色劑
100ul
100ul
100ul
100ul
室溫避光溫育30min
終止液
100ul
100ul
100ul
100ul
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值

1)  確定好空白對(duì)照孔,并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2)  確定好樣品對(duì)照孔,檢測(cè)樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔,然后分別將100ul樣品對(duì)照品、檢測(cè)樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。
3)  蓋板,37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜
4)  用洗滌瓶洗板,在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒,棄取洗滌液。重復(fù)7次,zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機(jī)洗板時(shí),用洗板機(jī)洗四次后,在用洗滌瓶洗3次。
5)  每孔加100ul酶標(biāo)抗體,除試劑空白對(duì)照孔外
6)  蓋板,4℃下溫育30min
7)  按照步驟4)洗板9次
8)  將所需量的顯色劑加入到試管中,然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染,請(qǐng)勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9)  室溫避光溫育30min,加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色
10)在每孔加100ul終止液,此時(shí)溶液顏色會(huì)變成黃色。
11)              擦去微孔板底部的污點(diǎn)或水滴,終止液加入后30min內(nèi),在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)
特別注意
1.       試驗(yàn)樣品采集后應(yīng)立即檢測(cè),凍存的樣品避免反復(fù)凍融,檢測(cè)前應(yīng)先將其*溶解混勻
2.       試驗(yàn)樣品用EIA緩沖液稀釋
3.       試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)做雙份檢測(cè)
4.       試驗(yàn)樣品應(yīng)在中性PH范圍,有機(jī)溶劑的污染可能會(huì)影響檢測(cè)
5.       只能用試劑盒提供的洗滌液洗板,否則會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗
6.       吸水紙上拍干微孔板,不能擦拭
7.       TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處,因其對(duì)光敏感,且避免接觸金屬
8.       加入終止液后30min內(nèi)必須酶標(biāo)儀讀數(shù)
9.       肝素血漿樣品的檢測(cè)值低于EDTA血漿樣品
結(jié)果計(jì)算
   繪制曲線前,所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗(yàn)樣品空白值,包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度在對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
 
附:采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè),只需檢測(cè)前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù),如坐標(biāo)參數(shù)(線性,半對(duì)數(shù))和計(jì)算方式參數(shù)(三次回歸、四參數(shù)或雙對(duì)數(shù)曲線方程),即可直接得到結(jié)果
 
 
本譯文僅供參考,詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。
 
 
 
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公司地址:深圳市南山區(qū)蛇口沿山路10號(hào)6層。:518067
:(8線) 傳真:+86 755 26814431
免費(fèi)訂貨:。
技術(shù)咨詢:,;手機(jī),;,kerunda@szonline.net。
歡迎索取詳細(xì)資料,在線:kerunda_tech

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