深圳市科潤達生物工程有限公司
中級會員 | 第17年

15711973608

VEGF ELISA試劑盒

時間:2011/11/12閱讀:1495
分享:
VEGF ELISA試劑盒
日本IBL*,貨號:27171
日本IBL中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務
前言說明
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種同型二聚體蛋白,zui初人們是從富含正常牛垂體濾泡星形蛋白細胞的基質(zhì)中分離純化得到,由各種血管組織分泌。后來人們發(fā)現(xiàn)VEGF與一種血管通透因子(VPF)相同, VPF是之前在富含腫瘤細胞系的基質(zhì)中鑒別得到的,腫瘤細胞可以提高毛細血管的通透性。據(jù)報道,VEGF的活性包括促進內(nèi)皮細胞的生長,促進血管的生成和提高毛細血管的通透性。VEGF是一種分子量為38.2kDa的同型二聚體,它由兩條含165個氨基酸的多肽鏈組成。多數(shù)人腫瘤細胞都會分泌VEGF,包括:人肺腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、纖維肉瘤、HL60早幼粒細胞性白血病、GS-9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤和U937淋巴瘤細胞。一些正常的組織也會分泌VEGF,如:活化的巨噬細胞、角質(zhì)化細胞、肝細胞、平滑肌細胞、間質(zhì)細胞、胚胎成纖維細胞、支氣管及脈絡叢上皮細胞,腎小球內(nèi)臟上皮及其系膜細胞。IBL公司的人VEGF ELISA試劑盒可用于人EDTA血漿和細胞培養(yǎng)上清中VEGF的定量檢測。
實驗原理
此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒,使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑,zui終溶液所顯示的顏色強度與樣品中VEGF的量成正比。
測定范圍
15.63~1000pg/ml (*次溫育:37℃下溫育60min)
7.81~500pg/ml (*次溫育:4℃下溫育過夜)
預期用途
此試劑盒可用于人EDTA血漿和細胞培養(yǎng)液上清EGF的體外定量檢測。此試劑可識別天然的和重組的VEGF。利用夾心法的酶聯(lián)免疫吸附實驗,采用用了高特異性的多克隆抗體和單克隆抗體。
試劑盒成分
1)  包被板:微孔中包被了抗人VEGF-1(16F1)的鼠IgG單克隆抗體,96孔。
2)  濃縮型酶標抗體:HRP標記的抗人VEGF-1兔IgG Fab片段,30倍濃縮,0.4ml
3)  標準品:內(nèi)含重組的人VEGF 165,0.5ml×2
4)  EIA緩沖液:1%的BSA,含0.05%的吐溫的PBS,30ml
5)  酶標抗體稀釋液:內(nèi)含的1%BSA、0.05%吐溫20的PBS,12ml
6)  顯色劑:TMB底物液,15ml
7)  終止液:1N的H2SO4,12ml
8)  濃縮洗滌液:內(nèi)含0.05%吐溫的磷酸緩沖液(40倍濃縮),50ml。
實驗所需器材但試劑盒不提供


 

l         酶標儀(450nm)
l         帶刻度的量筒與燒杯
l         孵箱(37℃±1℃)
l         吸水紙
l         冰箱(4℃)
l         試管
l         微量移液器和取樣吸頭
l         去離子水
l         坐標紙(log/log)
l         用于稀釋標準品的試管
l         洗滌瓶


 

試劑準備
1.       洗滌緩沖液制備:先將洗滌濃縮液平衡至室溫,充分混勻,然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻,即得。配制的洗滌液應保存于冰箱內(nèi),并于2周內(nèi)使用
2.       標記抗體的制備:用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍,即得。
例:如果只測一條板,8孔,則需要標記抗體800ul(30ul的標記抗體+870ul的標記抗體稀釋液,混勻,使用時每孔加100ul)
此步驟在實驗前完成
剩余的標記抗體濃縮應裝于密封瓶內(nèi),保存在4℃
3.       標準品的制備:吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內(nèi),充分混勻,得到2000pg/ml的人VEGF標準品
4.       標準品的稀釋:準備8個試管用于標準品的稀釋,每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管                 1000pg/ml
2號管                 500pg/ml
3號管                 250pg/ml
4號管                 125pg/ml
5號管                62.5pg/ml
6號管                 31.25pg/ml
7號管                15.63pg/ml
8號管                 0pg/ml(試驗樣品空白)
吸取230ul的標準品于1號管混勻,然后從1號管吸取230ul加入2號管,依次連續(xù)稀釋,標準品范圍為1000~15.63pg/ml
 
5.       樣品稀釋:樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有估計,我們建議,先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測,來確定樣品的*稀釋比例
實驗步驟
使用前,所有樣品應平衡至室溫,大約30min,然后充分混勻,確保試劑質(zhì)量無變化,標準曲線和樣品檢測同時進行

試劑
檢測樣品
標準品
檢測樣品對照孔
試劑對照孔
檢測樣品100ul
稀釋標準品(1-7管)100ul
EIA緩沖液(第8管) 100ul
EIA緩沖液100ul
蓋板,37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜
洗板7次
酶標抗體
100ul
100ul
100ul
-
蓋板,4℃下溫育30min
洗板9次
顯色劑
100ul
100ul
100ul
100ul
室溫避光溫育30min
終止液
100ul
100ul
100ul
100ul
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值

1)  確定好空白對照孔,并在相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2)  確定好樣品對照孔,檢測樣品孔和標準品孔,然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品加入到相應的微孔中。
3)  蓋板,37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜
4)  用洗滌瓶洗板,在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒,棄取洗滌液。重復7次,zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時,用洗板機洗四次后,在用洗滌瓶洗3次。
5)  每孔加100ul酶標抗體,除試劑空白對照孔外
6)  蓋板,4℃下溫育30min
7)  按照步驟4)洗板9次
8)  將所需量的顯色劑加入到試管中,然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染,請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9)  室溫避光溫育30min,加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10)在每孔加100ul終止液,此時溶液顏色會變成黃色。
11)              擦去微孔板底部的污點或水滴,終止液加入后30min內(nèi),在酶標儀450nm處讀數(shù)
特別注意
1.       試驗樣品采集后應立即檢測,凍存的樣品避免反復凍融,檢測前應先將其*溶解混勻
2.       試驗樣品用EIA緩沖液稀釋
3.       試驗樣品和標準品應做雙份檢測
4.       試驗樣品應在中性PH范圍,有機溶劑的污染可能會影響檢測
5.       只能用試劑盒提供的洗滌液洗板,否則會導致試驗失敗
6.       吸水紙上拍干微孔板,不能擦拭
7.       TMB底物液應貯存于黑暗處,因其對光敏感,且避免接觸金屬
8.       加入終止液后30min內(nèi)必須酶標儀讀數(shù)
9.       肝素血漿樣品的檢測值低于EDTA血漿樣品
結(jié)果計算
   繪制曲線前,所有的數(shù)據(jù)都應減去試驗樣品空白值,包括標準品和未知的樣品。以標準品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線,從標準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
 
附:采用全自動酶標儀檢測,只需檢測前設(shè)置好酶標儀的相關(guān)參數(shù),如坐標參數(shù)(線性,半對數(shù))和計算方式參數(shù)(三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程),即可直接得到結(jié)果
 
 
本譯文僅供參考,詳情請以原文為準。
 
 
 
中國*總代理:深圳市科潤達生物工程有限公司
公司地址:深圳市南山區(qū)蛇口沿山路10號6層。:518067
:(8線) 傳真:+86 755 26814431
免費訂貨:。
技術(shù)咨詢:,;手機,;,kerunda@szonline.net。
歡迎索取詳細資料,在線:kerunda_tech

會員登錄

×

請輸入賬號

請輸入密碼

=

請輸驗證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏!
標簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個,單個標簽最多10個字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時間回復您~
撥打電話
在線留言