H1-H5孔包含了5個(gè)看家基因（HK1-HK5），用于芯片數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。H6為基因組DNA參照（GDC），其中固定的引物能特異性的檢測(cè)非轉(zhuǎn)錄的基因組DNA重復(fù)片段，從而檢測(cè)樣品中是否存在DNA污染。H7到H9是三個(gè)重復(fù)的孔，均為反轉(zhuǎn)錄參照（RTC），用于檢測(cè)RT反應(yīng)的效率。H10到H12是陽性PCR參照（PPC），反映了PCR反應(yīng)的效率。這些孔中加入了人工合成的DNA序列和相應(yīng)的引物對(duì)。兩組重復(fù)的對(duì)照RTC和PPC也可以用于檢測(cè)芯片間和芯片內(nèi)的一致性。
預(yù)設(shè)計(jì)的信號(hào)通路特異性PCR芯片
96孔模式的RT2Profiler PCR芯片根據(jù)SuperArray的Pathway-Centric TM原理設(shè)計(jì)，將現(xiàn)有的重要信號(hào)通路研究進(jìn)展與PCR芯片方法結(jié)合，是檢測(cè)信號(hào)通路提供*的研究工具。在設(shè)計(jì)PCR芯片時(shí)，Superarray公司綜合了文獻(xiàn)資料，數(shù)據(jù)庫信息，專家意見和用戶反饋，不斷根據(jù)客戶需要開發(fā)新產(chǎn)品，并使芯片中所包含的基因更完整，更。在目前的市場(chǎng)中，SuperArray所提供的信號(hào)通路范圍zui廣，并且有針對(duì)人，小鼠和大鼠的PCR 芯片產(chǎn)品（參見表1以及產(chǎn)品目錄）。在芯片設(shè)計(jì)中，還整合了預(yù)測(cè)資料和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，幫助研究者系統(tǒng)地有針對(duì)性的開展研究。這些預(yù)設(shè)計(jì)的PCR芯片，分類詳細(xì)，針對(duì)性強(qiáng)，使研究者無需自己一一挑選基因，節(jié)省大量時(shí)間和精力，實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)便快速，大大推進(jìn)了生命科學(xué)研究進(jìn)展。目前，預(yù)設(shè)計(jì)的PCR芯片涵蓋了細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)，信號(hào)傳導(dǎo)，癌癥以及其他疾病等廣泛的生物學(xué)通路和疾病。詳細(xì)的芯片列表請(qǐng)登陸公司查詢。
| 應(yīng)用范圍 | PCR芯片產(chǎn)品舉例 | 芯片所包含的部分基因 |
| 生物學(xué)途徑 | 人細(xì)胞凋亡 （Cat. No. APHS-012） | TNF 配體和受體 BCL2 家族成員 Caspases 死亡效應(yīng)功能域 ATM和p53信號(hào)通路 |
| 功能或者結(jié)構(gòu)相關(guān)基因 | 小鼠細(xì)胞因子 （Cat. No. APMM-021） | 干擾素和白介素 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 腫瘤壞死因子 多種生長(zhǎng)因子 |
| 信號(hào)傳導(dǎo)途徑 | 人NFKB信號(hào)通路 （Cat. No. APHS-025） | 細(xì)胞外配體和受體 NFκB和IκB 家族成員 激酶 轉(zhuǎn)錄因子 反應(yīng)基因 |
| 疾病相關(guān) | 人癌癥信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)者 （Cat. No. APHS-033） | 細(xì)胞周期控制和DNA損傷修復(fù) 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老 細(xì)胞黏附 血管生成 浸潤(rùn)和腫瘤轉(zhuǎn)移 |
表1 SuperArray 提供的PCR Array產(chǎn)品舉例
訂制的PCR芯片
如果現(xiàn)有的產(chǎn)品無法滿足研究者的特定需要，SuperArray還可以提供從設(shè)計(jì)到芯片生產(chǎn)的完整服務(wù)，為研究者提供使用先進(jìn)的PCR芯片的便捷服務(wù)。客戶訂制芯片服務(wù)為研究者提供以下便利：1）在使用表達(dá)譜基因組芯片后，對(duì)從基因組水平篩選出來的一組基因進(jìn)行驗(yàn)證；2）在現(xiàn)有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上作適當(dāng)調(diào)整以適應(yīng)特殊需要；3）*從頭設(shè)計(jì)，適用于在現(xiàn)有的預(yù)設(shè)計(jì)PCR芯片中尚未包括的某個(gè)信號(hào)通路或者一組基因。若研究基因數(shù)目少于84個(gè)，還可以將96孔PCR芯片進(jìn)一步分成更小的形式，從而可以在一次PCR反應(yīng)中研究多個(gè)樣品。或者進(jìn)行多次重復(fù)。
有了這些產(chǎn)品和服務(wù)，研究者在利用這項(xiàng)新技術(shù)時(shí)，可以專注于研究自己所感興趣的特定基因組合時(shí)，實(shí)驗(yàn)中也更加省時(shí)省力。
PCR 芯片實(shí)驗(yàn)體系
完整的PCR芯片實(shí)驗(yàn)體系包括RT2ProfilerTM PCR芯片，RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反應(yīng)體系和cDNA合成試劑盒。所有這些組分均為基于SYBR Green的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)優(yōu)化。精心設(shè)計(jì)的引物和優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系一起，為PCR芯片的特異性提供保證。在反應(yīng)體系中還加入了指示染料，用于檢測(cè)PCR反應(yīng)平臺(tái)的可靠性。
RT2 PCR引物和RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反應(yīng)體系
采用PCR芯片開展研究，技術(shù)上的難點(diǎn)是如何在同一次實(shí)驗(yàn)中，相同的PCR反應(yīng)條件下保證不同的基因有相近的擴(kuò)增效率，并且獲得與單個(gè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR反應(yīng)相當(dāng)?shù)撵`敏度，特異性和可重復(fù)性。為此，SuperArray首先設(shè)計(jì)篩選出*的候選引物，接著通過實(shí)驗(yàn)，在不同反應(yīng)條件下，檢測(cè)PCR反應(yīng)體系與幾千條PCR引物的組合，zui終獲得了優(yōu)化的引物和PCR反應(yīng)體系，適應(yīng)PCR芯片的要求。
RT2ProfilerTM PCR芯片引物的特點(diǎn)
通過計(jì)算機(jī)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，引物達(dá)到以下要求：
1.特異性：通過BLAST等比對(duì)方法，檢測(cè)確認(rèn)引物在相應(yīng)物種（人，小鼠或大鼠）全基因組中的高度特異性，有效避免非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生。并通過實(shí)驗(yàn)證明引物不會(huì)擴(kuò)增E.coli基因組，后者是Taq DNA多聚酶的常見污染源。
2.均一性：所使用的引物的CG含量，解鏈溫度（Tm），以及其他一些化學(xué)的和物理的特性都相似，以保證在相同的PCR條件（尤其是相同退火溫度）下，芯片中的不同的基因都能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。
3.擴(kuò)增效率：引物擴(kuò)增的片段大小均在100到200bp左右，確保在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，不同的基因均能擴(kuò)增出完整片段；并增強(qiáng)引物3’ 端的鉚定能力，減少引物二聚體和非特異性退火的發(fā)生。
RT2ProfilerTM PCR芯片PCR反應(yīng)體系的特點(diǎn)
在基于SYBR Green的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)體系也起到重要作用。嚴(yán)格控制的熱啟動(dòng)Taq酶是一個(gè)關(guān)鍵因素。RT2 Real-TimeTM PCR反應(yīng)體系采用了一種*的，經(jīng)過化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq酶，只有在熱激步驟之后，酶的活性才能*發(fā)揮。在嚴(yán)格控制反應(yīng)條件的情況下，在較低溫度下發(fā)生的非特異性引物結(jié)合無法進(jìn)一步擴(kuò)增。其他的反應(yīng)體系則常常將這些模板進(jìn)一步擴(kuò)增成為非特異性產(chǎn)物，造成假陽性結(jié)果。此外，Superarray還對(duì)RT2 Real-TimeTM PCR反應(yīng)體系中的化學(xué)組分進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步減少了引物二聚體的形成，并能保證zui難擴(kuò)增的片段都得到*的擴(kuò)增效率。PCR芯片結(jié)合了高質(zhì)量的PCR引物設(shè)計(jì)和RT2 Real-TimeTM PCR反應(yīng)體系，為PCR的高芯片質(zhì)量提供了保證。
表格2總結(jié)了RT2ProfilerTM PCR芯片的特點(diǎn)。
| 芯片設(shè)計(jì) | 84個(gè)通路特異性基因 |
| 5個(gè)看家基因 |
| 1個(gè)基因組DNA參照 |
| 3個(gè)反轉(zhuǎn)錄參照（RTC） |
| 3個(gè)陽性PCR參照（PPC） |
| 引物設(shè)計(jì) | 特異性：序列比對(duì)篩選 |
| 一致性：統(tǒng)一的熔解和退火溫度 |
| 反應(yīng)效率：短的擴(kuò)增片段 |
| 反應(yīng)體系 | 熱啟動(dòng)Taq酶： 避免引物二聚體等的產(chǎn)生 非特異性引物結(jié)合無法進(jìn)一步擴(kuò)增 |
| 反應(yīng)體系為SYBR green實(shí)時(shí)定量PCR優(yōu)化 |
表2 RT2ProfilerTM PCR芯片的特點(diǎn)
RT2ProfilerTM PCR芯片特點(diǎn)靈敏度
研究者總是希望能檢測(cè)到表達(dá)量相當(dāng)?shù)偷幕颍袝r(shí)候，研究者得到的起始總RNA量也很少，但仍希望能進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。為了滿足研究者的這些需要，Superarray嚴(yán)格檢測(cè)了PCR芯片系統(tǒng)的靈敏度。例如，Superarray使用PCR芯片檢測(cè)了一系列總RNA樣本，這些樣本的濃度都不相同，使用的PCR芯片為炎癥細(xì)胞因子和受體基因芯片，通常，這些基因的表達(dá)量都是很低的。圖3將陽性信號(hào)的比例（Ct<35的基因所占百分比）與相應(yīng)的總RNA量對(duì)應(yīng)起來作圖。結(jié)果表明，當(dāng)起始的總RNA范圍在5.0ng到1.0ug（甚至是5.0ug）時(shí)，每張PCR芯片的陽性信號(hào)比率均超過85%。對(duì)于表達(dá)量更高的基因，芯片檢測(cè)的靈敏度還會(huì)大大提高，即在起始RNA量更低的情況下，芯片能夠檢測(cè)到的陽性信號(hào)比例更高。值得注意的是，起始的總RNA量不要低于0.5-1.0ug，否則會(huì)造成陽性信號(hào)損失。由于陽性信號(hào)比例在起始RNA量低時(shí)會(huì)顯著下降，所以在實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)的zui低RNA量不少于5.0ng。
圖3 當(dāng)總RNA量低至5.0ng時(shí)，使用RT2ProfilerTM PCR芯片實(shí)驗(yàn)體系仍能獲得很高的陽性信號(hào)比例。
RNA樣品為XpressRefTM人總RNA（GA-004），起始RNA量分別為0.1，1.0，5，10，50，100和1000ng）。芯片為炎癥細(xì)胞因子和受體PCR芯片（APHS-011A）。采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 熒光素PCR反應(yīng)體系（PA-011）。陽性信號(hào)的比例（Ct<35的基因所占的百分比）與對(duì)應(yīng)的總RNA量做圖。
特異性
PCR芯片體系的設(shè)計(jì)和優(yōu)化都是針對(duì)基于SYBR green的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。由于SYBR Green與非特異的雙鏈DNA也會(huì)發(fā)生反應(yīng)，為了獲得高特異性，需要保證引物只擴(kuò)增出特定的目的片段，從而使基于SYBR Green的PCR芯片能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)基因表達(dá)水平。Superarray通過實(shí)驗(yàn)對(duì)設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行了驗(yàn)證，保證引物擴(kuò)增的產(chǎn)物是單一的，基因特異性的，沒有引物二聚體，也沒有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
下面是一個(gè)檢測(cè)PCR芯片特異性的實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)PCR芯片中TGFβ和骨形成蛋白（BMP）家族各基因的熔解曲線，并且對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，該家族的基因同源性很高。圖4顯示了BMP基因家族各基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線和電泳結(jié)果。如圖所示，各熔解曲線均為單峰，電泳條帶亦單一，并且條帶大小與預(yù)期值一致。結(jié)果表明， PCR 芯片擴(kuò)增出基因產(chǎn)物特異性高，即使相同RNA樣品中同一基因家族的同源基因也可以區(qū)別。優(yōu)化的體系在SYBR Green檢測(cè)中表現(xiàn)出高特異性，而這種特異性通常被認(rèn)為只能在使用更加昂貴的基于探針的方法才能獲得。
圖4 PCR芯片的高特異性 RT2ProfilerTM PCR芯片對(duì)所檢測(cè)的基因顯示出高特異性
RNA樣品為XpressRefTM人總RNA（GA-004，5ug），PCR芯片為人TGFb/BMP信號(hào)通路PCR 芯片（APH-03），采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 熒光素PCR反應(yīng)體系（PA-011）。通過標(biāo)準(zhǔn)熔解反應(yīng)步驟獲得熔解曲線（A），產(chǎn)物進(jìn)一步通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（B）。
重復(fù)性
實(shí)時(shí)定量PCR的定量特性使得PCR芯片的重復(fù)性強(qiáng)。為檢測(cè)重復(fù)性，2位研究者采用了同樣的總RNA樣品，分別進(jìn)行了4次重復(fù)試驗(yàn)。兩個(gè)人使用同種PCR芯片，但批號(hào)不同，并且每個(gè)人都分兩天進(jìn)行試驗(yàn)。比較兩位研究者分別做的4張芯片的原始Ct值。圖5顯示了比較結(jié)果的圖示和相關(guān)系數(shù)。每一組比較結(jié)果均獲得理想的曲線，斜率為1.0，相關(guān)系數(shù)均不小于0.99。結(jié)果顯示，PCR芯片實(shí)驗(yàn)體系的重復(fù)性高，不同批次的芯片，不同時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同的重復(fù)設(shè)計(jì)，在原始值水平都能獲得很高的重復(fù)性。
圖5 PCR芯片的重復(fù)性 PCR芯片具有高重復(fù)性
RNA樣品為XpressRefTM人總RNA（GA-004，5.0ug），PCR芯片為人藥物代謝PCR 芯片（APH-022A），采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 熒光素PCR反應(yīng)體系（PA-011）。兩位不同的研究者分別進(jìn)行了4次重復(fù)。A圖比較了原始的Ct值。B的表格則說明A中每組比較獲得的曲線的相關(guān)系數(shù)。
由于PCR芯片在技術(shù)上具備很高的重復(fù)性，在確保RNA樣品制備良好，PCR芯片實(shí)驗(yàn)操作正確的情況下，所觀察到的基因表達(dá)水平的差異都是所研究的樣本本身的生物學(xué)特征所引起的，而不是由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)所造成的差異。表3總結(jié)了RT2ProfilerTM PCR芯片的特點(diǎn)。
| 靈敏度高 | 在僅用5ng總RNA時(shí)，可獲得85%的陽性信號(hào) |
| 線性范圍廣 | 至少10的5次方 |
| 特異性強(qiáng) | 引物擴(kuò)增出單一的，靶基因特異的產(chǎn)物 |
| 重復(fù)性佳 | 同一實(shí)驗(yàn)室重復(fù)實(shí)驗(yàn)，比較原始Ct值的相關(guān)系數(shù)（R）≥0.99 不同實(shí)驗(yàn)室重復(fù)實(shí)驗(yàn)，比較基因表達(dá)倍數(shù)的相關(guān)系數(shù)（R）≥0.97 Ct的平均標(biāo)準(zhǔn)差為0.25 |
表3 RT2ProfilerTM PCR芯片的特點(diǎn)
總結(jié)：
RT2Profiler PCR芯片是研究一組特異性基因表達(dá)水平的理想方法?；赟YBR green 的實(shí)時(shí)定量PCR方法，適用面廣，簡(jiǎn)單方便，使PCR芯片具有廣泛的應(yīng)用前景。選擇合適的芯片模式和相應(yīng)的反應(yīng)體系，即可開展PCR芯片實(shí)驗(yàn)。芯片包括預(yù)設(shè)計(jì)的通路特異性PCR芯片或者客戶訂制PCR芯片。PCR芯片具有與實(shí)時(shí)定量PCR相當(dāng)?shù)撵`敏度，特異性和重復(fù)性。PCR芯片的設(shè)計(jì)思路，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)際完成實(shí)驗(yàn)的時(shí)間大大縮短，對(duì)結(jié)果的分析也更直接有效。使用PCR芯片，每張芯片使用的總RNA樣品量zui少可低至0.5ng，zui多則可達(dá)到5.0ug。PCR芯片的特異性保證擴(kuò)增產(chǎn)物的*性和基因特異性。因此，檢測(cè)得到的基因表達(dá)水平差異真實(shí)的反映了所要研究的基因的情況。PCR芯片的重復(fù)性（intra-lab的相關(guān)系數(shù)為0.99）保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可重復(fù)的。RT2Profiler PCR芯片結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR的優(yōu)點(diǎn)和芯片的高通量，是研究者開展研究的得力工具。
