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能夠影響反相色譜柱的因素有幾點(diǎn)

時(shí)間:2021-5-12 閱讀:2057
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  液相色譜柱按照其色譜分離模式來分,大致可分為正相、反相、離子交換、疏水作用、體積排除、親和以及手性等類型。其中反相色譜柱是以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。
  反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。
  反相色譜柱的影響因素:
  (1)柱長(zhǎng)
  有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長(zhǎng)的增加而增加.但是柱長(zhǎng)增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加.它們?cè)谳^短的柱子上往往也有很好的分離效果。
  (2)流動(dòng)相的流速。
  有機(jī)小分子和肽類的分辨率對(duì)流動(dòng)相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小,柱子越長(zhǎng),色譜峰的寬度就越大,分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附容量影響很大。
  (3)溫度。
  溫度上升,流動(dòng)相黏度下降,流動(dòng)速度加快,且流動(dòng)相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快,使分辨率增加。同時(shí),溫度上升,分子熱運(yùn)動(dòng)增加,疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
  (4)流動(dòng)相組成。
  流動(dòng)相的極性越大,溶質(zhì)的分配系數(shù)越大,洗脫時(shí)間越短。RPC多采用降低流動(dòng)相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性zui強(qiáng)的溶劑,在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用,向流動(dòng)相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑,以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相,這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外,乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會(huì)影響分辨率,一般梯度越小.分辨率越大。

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