一、菌落總數(shù)小常識(shí)

菌落總數(shù)的測定方法，看似非常簡單，但由于食品種類繁多，食品中可能存在的微生物菌群較多，要在同等條件下把所有的細(xì)菌培養(yǎng)出來，反應(yīng)樣品的真實(shí)情況，實(shí)屬不易。

一、能力實(shí)驗(yàn)的目的

開展能力驗(yàn)證試驗(yàn)是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測能力和提高檢測水平的重要手段。利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的校準(zhǔn)或檢驗(yàn)工作進(jìn)行判定。

關(guān)鍵是，能力驗(yàn)證是考察實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰Φ耐獠抠|(zhì)量活動(dòng)，組織方提供試驗(yàn)樣本，在菌落總數(shù)項(xiàng)目上，一般會(huì)考慮增加上述難度。

二、測定標(biāo)準(zhǔn)

食品國家標(biāo)準(zhǔn)：GB 4789.2-2022 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》

三、操作過程

（一）前期做好充足的準(zhǔn)備工作：

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，提前準(zhǔn)備好要用的平板計(jì)數(shù)瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等。

（二）樣品接受：

收到樣品后，確認(rèn)樣品包裝是否完好，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力驗(yàn)證平臺(tái)進(jìn)行確認(rèn)。

（三）樣品處理：

按照作業(yè)指導(dǎo)書操作（一定要仔細(xì)閱讀作業(yè)指導(dǎo)書）看看是幾個(gè)樣品及實(shí)驗(yàn)記錄要求。一般實(shí)驗(yàn)室收到的是干粉樣品或者是固體樣品等。假如收到的是干粉樣品，那么第一步就要水化。

樣品水化步驟（建議）：一般能力驗(yàn)證樣品以國體粉末形式發(fā)放，以液體（CFU/mL）形式出報(bào)告。樣品水化前一定要認(rèn)真、仔細(xì)閱讀作業(yè)指導(dǎo)書，看看用多少稀釋液水化，水化后作為原液還是多大濃度的樣品來記錄。

（四）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

a、能力驗(yàn)證時(shí)最好在超潔凈臺(tái)或者生物安全柜里操作，這樣就要把超潔凈臺(tái)或者生物安全柜提前清理、消毒處理，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境無菌。

b、提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作臺(tái)上。

（五）實(shí)驗(yàn)操作：

a、稀釋

將樣品從冰箱中取出達(dá)到室溫后開啟使用，在超潔凈臺(tái)或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進(jìn)行水化后吸入無菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進(jìn)行洗滌并全部轉(zhuǎn)入無菌瓶或袋中。（具體公需多少稀釋液要看作業(yè)指導(dǎo)書說明）

洗滌轉(zhuǎn)移時(shí)注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將全部的水化液進(jìn)行均質(zhì)混勻，一般作為原液立刻進(jìn)行接種；再取25mL到225mL稀釋液中均質(zhì)混勻，制成10-1梯度樣品勻液。

用1mL無菌吸管取1:10的樣液到9mL生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類推。再將幾個(gè)稀釋度的樣液接種到提前做好標(biāo)記的無菌平皿中。

b、傾注平板

將提前在水浴鍋里涼至48℃的平板計(jì)數(shù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。傾注過程一般左手拿平皿，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開30度左右的縫隙，傾注瓊脂大約到平皿底的二分之一處，左三圈、右三圈輕輕混勻，然后放到臺(tái)面上。

待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。

e、觀察計(jì)數(shù)

最好，第二天先看看，檢測結(jié)果有沒有異常、是否有蔓延菌落出現(xiàn)。

按照GB 4789.2的要求進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)

f、上報(bào)數(shù)據(jù)

在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析后，選取檢測結(jié)果的平均值進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)提交。

注意事項(xiàng)：

a.一般能力驗(yàn)證的樣品添加的菌落濃度都比較高，檢測過程一定要多做幾個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度多做幾個(gè)平板平行。

b.梯度稀釋：是關(guān)鍵步驟，必須盡可能地減少誤差（新手建議渦旋混勻，渦旋時(shí)間不宜過長，長時(shí)間離心力等作用下，微生物細(xì)胞可能死亡）。

c.傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在48℃恒溫裝置內(nèi)保溫，溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無沒有恒溫裝置保溫，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。

d.傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20mL不等，一般以15mL較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。

e.傾注過程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來。

f.為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時(shí)要盡可能放在中央部位，然后應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。 

g.瓊脂瓶放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現(xiàn)平皿不凝固現(xiàn)象；拿出傾注時(shí)要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈。

h.冷卻的過程不要著急，冷卻充分后再倒置放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，放置的時(shí)候要盡量避免放到風(fēng)機(jī)口處，每摞不要超過6個(gè)平皿。

i.檢驗(yàn)結(jié)束后所有的稀釋液樣品一定要放到冰箱里0-5℃冷藏，以備必須再用（一旦第二天發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)做錯(cuò)了，在做一次實(shí)驗(yàn)，死馬當(dāng)活馬醫(yī)）。