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SELDI蛋白質(zhì)純化鑒定
閱讀：2884 發(fā)布時(shí)間：2010-8-5
實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)
針對血清、血漿、體液、組織、真菌、細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)物以及植物等樣本的差異蛋白質(zhì)組研究，以蛋白質(zhì)芯片為載體，通過對目標(biāo)疾病樣本組及對照組之間進(jìn)行鑒定，以期找到能夠區(qū)分不同組別的差異峰，并通過對差異峰進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定找到與目標(biāo)疾病密切關(guān)聯(lián)的基因/蛋白。
一、目標(biāo)蛋白
1.利用SELDI-TOF-MS蛋白芯片系統(tǒng)尋找出蛋白表達(dá)譜中有意義的差異蛋白。
2.篩選符合p<0．05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異蛋白或由BPS聚類軟件計(jì)算得出的診斷模型組成蛋白。
二、目標(biāo)蛋白的分離純化
1.利用白蛋白/IgG去除試劑盒去除樣本中高豐度蛋白。
2.利用分子篩K30-100去除樣本中的分子量大于30-100Kda的蛋白。
3.利用與先前SELDI蛋白表達(dá)譜所用的蛋白質(zhì)芯片相一致的納米磁珠吸附包含目標(biāo)蛋白在內(nèi)的一類蛋白（如SELDI表達(dá)譜所用WCX2芯片則選用WCX磁珠）。
4.蛋白濃縮，將吸附后的蛋白液體匯集到EP管置于冷凍干燥機(jī)凍干8小時(shí)，即得到蛋白凍干干粉。
5.蛋白定量，總蛋白量需達(dá)到50-100ug，入量不夠可繼續(xù)按之前步驟增加樣品用量。
6.Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine -SDS-PAGE）。
三、膠內(nèi)蛋白質(zhì)原位酶解和質(zhì)譜鑒定
1.選取考馬斯亮藍(lán)染膠上的蛋白條帶，同時(shí)切下一個(gè)陽性對照點(diǎn)和陰性對照點(diǎn)（空白膠），用去離子水充分洗滌。
2.用含50％乙腈的25 mmo1碳酸氫銨溶液脫色3次，然后用乙腈吸干膠中的水分，膠粒自然揮發(fā)干燥。
3.經(jīng)二硫蘇糖醇（DTT）還原和碘乙酰胺（IAA）烷基化后，膠粒用乙腈脫水后自然揮發(fā)干燥；加入用25 mmo}／L碳酸氫銨溶液配成的適量胰蛋白酶溶液于各管中，室溫1小時(shí)后吸出酶溶液，再加入適量 25 mmol／L碳酸氧銨溶液使膠粒保濕，37℃保溫12 h。
4.吸出上清，加入5％三氟乙酸，50％乙腈溶液40℃保溫1 h，重復(fù)1次，合并上清，自然揮發(fā)干燥溶液終體積為5ml。
5.基質(zhì)選用Ⅱ一氰基一13一羥基肉桂酸，飽和地溶解在30％乙腈、lO％丙酮和0.1％的三氟乙酸中，用Bruker公司肽混合物作為外標(biāo)。質(zhì)譜采用Bruker公司BIFLEX型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS），在延遲解吸和反射模式下進(jìn)行譜圖的采集。
6.使用搜索引擎（http://www.matrixscience.com） Mascot在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索，終確定蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。
四、目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)驗(yàn)證
（一）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）驗(yàn)證鑒定出的蛋白質(zhì)
1.樣本處理：室溫血清自然凝固10-20分鐘，3000rpm離心20分鐘，收集上清。
2.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30被濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50ul,空白孔除外。
7.溫育、洗滌同上。
8.顯色：每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。
9.終止：每孔加終止液50ul，終止反應(yīng)。
10.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。
（二）免疫沉淀（Immunoprecipitation）和蛋白質(zhì)芯片檢測
1.取同一份血清樣本20ul,分成a、b兩等份。
2.a份加入目標(biāo)蛋白的ELISA Kit孔中，并且入40ul樣品稀釋液，溫育30分鐘。
3.30分鐘后分別在a、b血清樣本中加入PH=4.0的NaAc350ul和390ul，置振蕩器400-600轉(zhuǎn)/分, 4℃震蕩1小時(shí)。
4.洗脫2次，芯片加樣并讀取數(shù)據(jù)。