近年發(fā)展的時間分辨熒光測量技術(shù)以稀土離子為示蹤材料，具有測量靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定、定量分析量程寬、無放射性污染和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。我們采用時間分辨熒光測量技術(shù)，建立了AFP時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）。

　　一、材料與方法

　　1. 材料與試劑：抗AFP單克隆抗體A₁₃₇和A₄₇由無錫市第二制藥廠提供。Eu³⁺標(biāo)記盒、Eu³⁺發(fā)光增強液、AFP TRFIA藥盒和AFP參考標(biāo)準(zhǔn)，EG－G-Wallac產(chǎn)品。CA₁₉₉、CA₁₂₅和CA₁₅₃參考標(biāo)準(zhǔn)，CIBACORNING產(chǎn)品。AFP質(zhì)量控制血清（L：21～35μg/L；M：62～93μg/L；H：173.4～260.2μg/L），中國藥品生物制品鑒定所產(chǎn)品。全自動TRFIA檢測儀（Auto DELFIA 1235）為EG－G-Wallac產(chǎn)品。

　　2. 固相抗體制備：將A₄₇單抗用50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃

　　pH9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液,微孔板各孔加200μl，4℃放置過夜。BSA封閉后真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。

　　3. Eu³⁺-A₁₃₇制備：參照Eu³⁺標(biāo)記盒說明書操作。取溶解于0.155mol/L

　　NaCl的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃ pH8.5緩沖液A₁₃₇（2g/L）500μl加入含0.2mg的Eu³⁺-N₂-［p-異氰酸-芐基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu³⁺-DTTA）凍干粉的小瓶中，30℃磁力攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/L

　　Tris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×40cm）層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰。

　　4. 測定方法：采用平衡法建立AFP-TRFIA，即在包被有A₄₇的96孔微孔板上，每孔依次加入25μl AFP參考標(biāo)準(zhǔn)或待測血清，200μl以反應(yīng)緩沖液1:1000稀釋的Eu³⁺-A₁₃₇，25℃振蕩孵育1h后，用洗滌液洗滌6次。再加增強液200μl，25℃振蕩反應(yīng)5min，熒光檢測。全部過程均在Auto

　　DELFIA 1235上自動完成，軟件設(shè)置由本所自編。

　　5. 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計處理：AFP-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線由Auto DEFIA 1235自帶的Log-Logit函數(shù)處理。精密度圖和可測范圍分析用吳德福IRMA數(shù)據(jù)處理軟件。統(tǒng)計學(xué)處理用t 檢驗。

　　二、結(jié)果

　　1.Eu³⁺-A₁₃₇的理化和免疫學(xué)鑒定：Eu³⁺-A₁₃₇以EG－G-Wallac提供的Eu³⁺標(biāo)準(zhǔn)為參考，平均每個A₁₃₇ IgG上連接了7.52個Eu³⁺，產(chǎn)率達53.07%。選擇AFP參考標(biāo)準(zhǔn)高點（1000μg/L），Eu³⁺-A₁₃₇ 1:1000稀釋，進行TRFIA，Bmax/T為6.65%，與低點（1μg/L）的發(fā)光計數(shù)差達2個數(shù)量級以上。被測物和反應(yīng)發(fā)光計數(shù)基本成算術(shù)級數(shù)正比關(guān)系。

　　2.AFP-TRFIA的考核：經(jīng)Log-Logit函數(shù)處理程序處理得AFP-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）方法的特異性：將CEA、CA₁₉₉、CA₁₂₅和CA₁₅₃分別配成10～500U/ml、15.8～409U/ml、12.1～732U/ml和27.7～243U/ml一系列不同濃度，代替標(biāo)準(zhǔn)曲線中的AFP參考標(biāo)準(zhǔn)。在上述濃度范圍內(nèi)，CEA、CA₁₉₉、CA₁₂₅和CA₁₅₃對AFP-TRFIA均無交叉反應(yīng)。（2）精密度和回收率：本方法的批內(nèi)和批間CV分別為1.59%和7.14%，8批標(biāo)準(zhǔn)曲線的ABCV均小于0.0114，精密度圖顯示可測范圍為4.22～1210μg/L，回收率為103.98%。（3）靈敏度和穩(wěn)定性：以零劑量點發(fā)光值均值加2s后的發(fā)光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的相應(yīng)值為0.43μg/L。8條不同時間進行的AFP-TRFIA的效點均值ED₂₀、ED₅₀和ED₈₀分別為（4.25±0.21）μg/L、（35.59±0.19）μg/L和（246.90±0.96）μg/L。

　　三、討論

　　TRFIA測量儀已進入第三代，分析技術(shù)已實現(xiàn)高度自動化。我們所建方法適于測量血清AFP的含量，Eu³⁺-A₁₃₇經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線比較鑒定，免疫反應(yīng)性基本無損失；其凍干品-30℃保存13個月后免疫反應(yīng)參數(shù)基本未改變。用國家的AFP質(zhì)控血清作樣品進行分析，L、M和H分別為28.0μg/L、77.5μg/L和216.8μg/L，符合質(zhì)控要求。我們曾把高含量的AFP血清樣品經(jīng)1:10～1000稀釋后用于本方法的測定，換算后的AFP含量非常接近；用該系列稀釋血清代替AFP參考標(biāo)準(zhǔn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其斜率與AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率基本一致，表明AFP-TRFIA有良好的健全性，血清基質(zhì)對本方法沒有明顯影響。8孔重復(fù)4組參考標(biāo)準(zhǔn)點的ABCV均＜0.06，批內(nèi)及批間重復(fù)性研究亦證明本方法是可靠的。以往超微量免疫分析技術(shù)每次分析，即使單樣品檢測也必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線作相對測量的依據(jù)。我們建立的AFP-TRFIA同批試劑連續(xù)5個月應(yīng)用分析，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，無明顯漂移，可以用同批試劑單次標(biāo)準(zhǔn)曲線為今后分析的固定參考。這既可減輕臨床應(yīng)用的工作強度，又可提高藥盒的經(jīng)濟價值。

　　AFP-TRFIA受檢血清用量僅為RIA或IRMA的四分之一，有利于減少樣品對分析系統(tǒng)的干擾，也有助于節(jié)約樣品，便于多指標(biāo)分析。AFP-TRFIA的分析時間僅為1h，且分析系統(tǒng)高度自動化，這樣可提高臨床檢驗結(jié)果的速度，又可大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。