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蛋白質(zhì)純化離子交換法
閱讀:998 發(fā)布時(shí)間:2011-1-4各種蛋白質(zhì)分子上可能帶有不同的電性,經(jīng)過(guò)離子交換管柱,可依其分子帶電性的差異而分離開(kāi)來(lái) (Pharmacia 操作手冊(cè), Ion Exchange)。
儀器設(shè)備:
塑料管柱 (Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm)
分劃收集器 (fraction collector, 另需準(zhǔn)備干凈試管約60 支)
濃縮用離心機(jī) (低速5,000 rpm) 及濃縮離心管Centriplus
藥品試劑:
DEAE Sephacel (膠體體積約15 mL,預(yù)先以緩沖液Buffer A-0 平衡好)
Buffer A-0 (如上述配法)
Buffer A-300 溶離液:Buffer A-0 加有0.3 M NaCl
Buffer A-500 溶離液:Buffer A-0 加有0.5 M NaCl
方法步驟:
1) 將Econo-Pac 管柱架好,并將三向閥及軟管等組合完成。
2) 震蕩DEAE Sephacel 膠體使的懸浮,小心倒入管柱中,讓膠體慢慢沈降,在沈降過(guò)程中隨時(shí)加入buffer A-0,勿使膠體干掉。
3) 待膠體沈降*后,高度應(yīng)在15 cm 左右。膠柱以buffer A-0 一直流洗,流速快慢可以不考慮;連接好收集器,每試管收2.5 mL。離子交換法的膠體平衡極為重要,可測(cè)流出液的pH 或離子濃度,看是否與buffer A-0 相同,若不一樣則需要再流洗的。
4) 樣本的添加方法同上述膠體過(guò)濾法,并啟動(dòng)分劃收集器開(kāi)始收集,當(dāng)樣本全部沒(méi)入膠體后,再加入同體積buffer A-0。以buffer A-0 流洗50 mL 后,去除膠體上方的緩沖液,但勿使膠體干掉。
5) 然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶離的,每批次流洗各50 mL,注意更換濃度時(shí),膠體上方勿殘存上一種溶液。
6) 收集所有分劃,進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS 活性測(cè)定,結(jié)果作圖。
7) 收集GUS 活性區(qū),并以Centriprep-30 濃縮至 _______ mL (IEX),記得要保留100 μL。
8) 離子交換膠體以buffer A-0 洗過(guò)50 mL 后,收起來(lái)交回。